重组质粒的连接、转化及筛选实验方法的实践谁能总结一下,我写生物论文需要了解一下这方面的知识
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[实验要点总结]
1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关,连接平齐末端,必须加大酶量,一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。
2、在连接带有粘性末端的DNA片段时,DNA浓度一般为2-10mg/ml,在连接平齐末端时,需加入DNA浓度至100-200mg/ml。
3、连接反应后,反应液在0℃储存数天,-80℃储存2个月,但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定,所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃,在连接粘性末端时,反应温度以10-16℃为好,平齐末端则以15-20℃为好。
5、在连接反应中,如不对载体分子进行去5'磷酸基处理,便用过量的外源DNA片段(2-5倍),这将有助于减少载体的自身环化,增加外源DNA和载体连接的机会。6、LB选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选,且价格低廉。但需及时挑取白色菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色,影响挑选。
7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside),为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表达。
8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显。
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楼上介绍的蛮详细的了
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