怎样用纸层析法测定胡萝卜素?

【专家解说】：楼主你好: 胡萝卜素是维生素A前体，可在人体内转变为维生素A。结构上分为旷，p和r胡萝卜素三种形式。天然胡萝卜素主要来源于植物，如胡萝卜、绿叶蔬菜等，其中以p胡萝卜素含量最高，活性最强。胡萝卜素本身是一种色素，在450:nm波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取p胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其他色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。 胡萝卜素的测定 胡萝卜素是维生素A前体，可在人体内转变为维生素A。结构上分为旷，p和r胡萝卜素三种形式。天然胡萝卜素主要来源于植物，如胡萝卜、绿叶蔬菜等，其中以p胡萝卜素含量最高，活性最强。胡萝卜素本身是一种色素，在450:nm波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取p胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其他色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。 纸层析法 1.原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分开。剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450 nm波长下进行比色测定。 2.仪器 ①玻璃层析缸。 ②分光光度计。 ③旋转蒸发器，具150 mL球形瓶。 ④恒温水浴锅。 ⑤皂化回流装置。 ⑥点样器或微量注射器。 ⑦滤纸。 3.试剂 ①石油醚(沸程30~60℃)。 ②丙酮。 ③丙酮一石油醚混合液:3:7(WV)。 ④无水硫酸钠(分析纯)。 ⑤5%硫酸钠溶液(M/V)。 ⑥1:1氢氧化钾溶液(M/、/r)。 ⑦无水乙醇:需脱醛处理，方法同比色法测定维生素A试剂。 ⑧胡萝卜素标准溶液:取5 mg p胡萝卜素标准品，溶于10 mL三氯甲烷中，浓度约为500Ug??mI标定:吸取标准溶液10肚I。，加正己烷3.00 mI。，混匀。用1 cm比色皿，以正己烷为空白，在450 nm波长下测定吸光值，平行测定3份，取平均值。 4.测定步骤 ①样品提取与洗涤 a.粮食用水洗3次，置60℃烤箱中烤干，磨粉，贮于塑料瓶中，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。 b.蔬菜与其他植物性食品取可食部分用水洗3次后，用纱布吸去水滴，打成匀浆。取适量磨细或打成匀浆的样品(含胡萝卜素20~80肛g)置于1。0 mI。带塞的锥形瓶中，加人20 mL丙酮、5 mI。石油醚，振摇1 min，静止5 min，将提取液转人盛有100 mL 5%硫酸钠溶液的分液漏斗中。之后再用10 mI，丙酮一石油醚混合溶液提取2~3次，直至提取液无色为止。将所有提取液并人分液漏斗中，静止分层，弃去下层水溶液，用15 mI。5%硫酸钠振摇洗涤数次，至水层不再混浊。 c.植物油和高脂肪样品:提取前需要进行皂化。取1~10 g样品，加乙醇30 mI。，l:1氢氧化钾10 mL，加热回流30 min，取出放人冰水中速冷。用石油醚提取皂化液，用水洗涤至中性。 ②浓缩与定容:将石油醚提取液经无水硫酸钠(约5 g)滤人与旋转蒸发器配套的250~300 mI一球形蒸发瓶内，用约10 mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，洗液并人蒸发瓶内，接旋转蒸发器，于55℃水浴中减压蒸馏回收石油醚。待瓶中剩下约2 mI。石油醚时，取下蒸发瓶，用氮气冲干。立即加入2.00 mI。石油醚定容。 ③纸层析 a.点样:在图10一1的滤纸下端距底边4 cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点。吸取O.100~O.4。0 mL(随胡萝卜素含量而定，估计吸光值在0.1~O.7之间)样品浓缩液在AB两点之间和CD两点之间迅速来回进行带状点样，一次点完。 b.展开:待纸上所点样液自然挥发至干后，将滤纸卷成圆筒状，将两边连接固定，基线处于纸筒底端。(更多详细咨询请参考国家标准物质网www.rmhot.com)置于预先用石油醚饱和过的层析缸内，上行展开(层析缸应事先用石油醚饱和，并且防止水分进入)。 c.洗脱:待胡萝卜素与其他色素完全分离后，取出滤纸，石油醚自然挥发至干。剪下位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带，立即放人盛有5 mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中 ④比色测定:用1 cm比色皿，以石油醚调节零点，于450 nm波长下测定吸光度，以其值从标准曲线上查出相应伊胡萝卜素的含量。 ⑤标准曲线的绘制取:p一胡萝卜素标准使用液(50弘g/mI。)1.00，2.OO，3.00，4.00，6.00，8.00 mI。，分别置于100 mL具塞锥形瓶内，按样品测定步骤进行提取、洗涤、纸层析等操作，点样体积为0.100 mL，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为2.50、5.00、7.50、10.OO、15.00、20.00 pg。为测定低含量样品，可在0~2.50弘g加做几点。以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 5.计算 6.说明 ①此法为国家标准方法，方法简便，色带清晰，最小检出限为O.11Ug。 ②所有的操作步骤都需在避光条件下进行。 ③浓缩提取液时，一定要防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速.