肺炎病患下呼吸道及沼气发酵体系的宏基因组学研究

【摘要】：作为一个新兴的研究领域,宏基因组学为微生物研究开拓了新的空间。宏基因组学凭借其高新的技术,已经渗透到众多复杂环境研究领域,例如海洋、土壤、热泉、人体口腔及胃肠道、替代能源、环境修复、农业和生物防御等。正常人体下呼吸道是一个相对封闭的无菌环境,细菌侵染下呼吸道会对人体健康乃至生命造成极大的威胁。目前人体下呼吸道微生物组研究由于受到取样方法等问题的限制,研究尚不够深入。而在人体环境之外其他封闭环境中,例如沼气发酵体系,宏基因组学研究也尚在起步阶段。沼气发酵体系宏基因组学研究,可以揭示发酵体系内菌群功能特征,对提高甲烷产气量、指导工业化生产有重要意义。 本文针对人体内、外环境分别选取肺炎病患下呼吸道和沼气发酵体系为代表,优化了不同样品DNA获得方法,通过高通量测序和生物信息学手段,分析研究了两种相对封闭环境的微生物群落特征,发现了一些鲜有报道但有重要作用的菌种。 肺炎病患下呼吸道宏基因组学研究中,为避免上呼吸道及口腔菌群的干扰,选取病人的支气管肺泡灌洗液为样本,获得了下呼吸道样品总DNA。通过反向杂交筛选方法,利用链霉亲和素磁珠偶联生物素探针,杂交去除人类基因组DNA。经过进一步Real-time PCR检测和454焦磷酸测序,证明经过处理的样本不仅保持了高丰度菌群的群落特征,还对中低丰度菌群有良好的覆盖。通过生物信息学分析,鉴定了20种呼吸道重症感染相关细菌物种,发现了两种呼吸道潜在致病菌Microbacterium laevaniformans和Borrelia garinii,检测到4种耐药基因和6种细菌侵染所需的毒力因子。宏基因组学研究结果与患者的临床症状相吻合,为快速诊断及合理用药提供了依据。 沼气发酵体系宏基因组学研究中,比较并优化了总DNA的提取方法。利用454焦磷酸测序技术和生物信息分析手段,获得了厌氧发酵产甲烷体系中微生物群落的整体特征,并发现不同提取方法中细胞裂解手段与裂解程度对后续菌群分析有着显著影响。对菌群分布的研究发现,高丰度菌群主要参与蛋白质、脂肪、纤维素以及其他大分子聚合物降解。通过基因功能注释检测到体系内存在食乙酸和食氢两种代谢途径。本体系中新发现两种优势菌属Psychrobacter和Anaerococcus。其中,Psychrobacter含有低温脂肪水解酶,在中低温发酵应用中具有潜在价值。而Anaerococcus属在本研究体系中大量存在,也揭示它在生物质降解产甲烷过程中的巨大潜能。这些研究结果,为优化中低温固态厌氧沼气发酵工艺、提高甲烷产气量提供了依据。 【关键词】：宏基因组学 焦磷酸测序 反向杂交筛选 生物信息学分析
【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R563.1;Q78
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 专业词汇中英文对照表9-10
• 目录10-12
• 图目录12-13
• 表目录13-14
• 1 引言14-22
• 1.1 宏基因组学概论14-15
• 1.2 宏基因组学研究手段的发展15-18
• 1.2.1 传统宏基因组学研究手段15-17
• 1.2.2 高通量测序技术的发展17-18
• 1.2.3 研究瓶颈与挑战18
• 1.3 不同研究策略对菌群丰度的影响18-22
• 2 肺炎病患下呼吸道宏基因组学研究22-62
• 2.1 概述22-28
• 2.1.1 呼吸道微生物研究22-23
• 2.1.2 技术路线23-28
• 2.2 材料与方法28-37
• 2.2.1 仪器与试剂28-31
• 2.2.2 模拟样品测试31-33
• 2.2.3 呼吸道样本测试33-35
• 2.2.4 呼吸道宏基因组分析35-37
• 2.3 结果与讨论37-58
• 2.3.1 反向杂交筛选效果37-40
• 2.3.2 综合评价与方法优化40-41
• 2.3.3 宏基因组测序数据统计41-43
• 2.3.4 下呼吸道菌群结构43-48
• 2.3.5 菌群生境与致病性48-55
• 2.3.6 毒力因子与耐药基因注释与分析55-58
• 2.4 小结58-62
• 3 沼气发酵体系宏基因组学研究62-92
• 3.1 沼气发酵体系概述62-64
• 3.2 材料与方法64-71
• 3.2.1 底物采集与人工驯化64-65
• 3.2.2 DNA提取方法比较与优化65-68
• 3.2.3 沼气宏基因组学分析68-71
• 3.3 结果与讨论71-89
• 3.3.1 提取方法结果差异71-73
• 3.3.2 测序数据统计与比较73-75
• 3.3.3 沼气发酵体系菌群结构分析75-80
• 3.3.4 菌群特征80-82
• 3.3.5 产甲烷途径功能基因分析82-89
• 3.4 小结89-92
• 4 结论92-94
• 参考文献94-108
• 附录A108-110
• 附图1 评价体系BAP质粒标曲108
• 附图2 沼气发酵体系16SrDNA T-RFLP峰值锥形图108-109
• 附图3 沼气发酵体系高丰度菌种特性109-110
• 附录B110-121
• 附表1 痰液样品测序结果中检测到的细菌种类、分布与致病性110-111
• 附表2 Large contigs(大于9kb)注释信息111-115
• 附表3 参与产甲烷途径contigs注释信息115-121
• 附录C 评价体系BAP质粒序列与检测片段121-122
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果122
• 作者简历122
• 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果122
• 已申请的专利122

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