产甲烷短杆菌M1膜蛋白EhaF异源表达及其对山羊甲烷排放影响的研究

【摘要】：降低反刍动物甲烷的排放,不仅能提高其对饲料的利用率,还可以减轻温室效应,缓解气候变暖,具有重要的生产实践意义和环境保护意义,但目前还缺乏行之有效的技术手段。本试验将产甲烷短杆菌M1中编码膜蛋白EhaF的基因在大肠杆菌中表达,并研究表达产物免疫山羊后对山羊甲烷排放量和瘤胃古菌结构和组成的影响。先从产甲烷短杆菌Methanobrevibacter ruminantium M1全基因序列的适合于克隆和异源表达抗原蛋白的基因中,挑选出候选的抗原基因mru1407。以山羊瘤胃微生物DNA为模板,通过PCR扩增到候选基因,构建重组质粒pET30a(+)-mrul407,并将其转入大肠杆菌Rosseta中进行表达,利用Ni-NTA分离纯化出表达的重组蛋白EhaF,用质谱分析检测纯化蛋白EhaF的氨基酸序列。挑选12只健康山羊作为试验动物,按照体重相近原则将其分为对照组与免疫组,每组设6个重复,每个重复1头羊。所有试验动物统一饲喂精粗比为3：7的全混合日粮,经14天预饲期后开始正式试验。正式试验的第0天对照组注射1ml佐剂与1ml洗脱液组成的混合液,免疫组注射含4001μg重组蛋白EhaF的1ml洗脱液与1ml佐剂组成的混合液。在第35,49天分别加强免疫1次,并在第56天采集血液及唾液,抽取瘤胃液,冷冻保存备用。第63天,采用开放式呼吸测热室检测山羊甲烷排放量的变化。用ELISA法测定血清、唾液和瘤胃液抗体滴度指标,用自动生化分析仪检测血液红细胞等常规指标及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮等生化指标。用DNA试剂盒在保存的瘤胃液中提取总DNA,利用古菌V4区引物PCR扩增瘤胃古菌V4区16s rDNA,利用Miseq测序的Illumina平台对扩增到的DNA进行高通量测序,得到的数据用Qiime软件分析,检测瘤胃菌古菌物种多样性及丰度,产甲烷菌含量的变化。结果表明：(1)产甲烷短杆菌M1膜蛋白EhaF能够在大肠杆菌内得到表达,并可用Ni-NTA对其纯化,表达的蛋白EhaF氨基酸序列与理论氨基酸序列完全一致。(2)对山羊注射蛋白EhaF能够引起山羊的免疫应答,免疫后的山羊唾液、血清及瘤胃液抗体滴度极显著升高(P0.01)。(3)注射重组蛋白EhaF对山羊血液常规指标血液生化指标无显著影响(P0.05)。(4)注射重组蛋白EhaF不能够显著降低山羊每公斤干物质甲烷排放量(P0.05)。(5)山羊瘤胃古菌主要由Euryarchaeota门的Methanobacteriaceae、Methanomicrobiaceae、Methanosaetaceae、Methanosarcinaceae、 Marine_Group_Ⅱ、vadinCA11_ gut_group共6个科组成,其中丰度最高的分别为Methanobacteriaceae科(58.43%),vadinCA11_gut_group科(37.8%),在属水平上丰度最高的古菌为Methanobrevibacter属(57.40%)。 (6)免疫重组蛋白EhaF对山羊瘤胃古菌的物种多样性及丰度无显著影响(P0.05)。(7)在属水平上,免疫重组蛋白EhaF对山羊瘤胃产甲烷菌属Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanomicrobium、 Methanosaeta、Methanimicrococcus的含量无显著影响(P0.05)。综上所述,产甲烷菌Methanobrevibacter ruminantium Ml的膜蛋白EhaF能够在大肠杆菌中正确表达,对山羊免疫重组蛋白EhaF可引起其免疫应答,但对山羊血液常规指标、生化指标、山羊甲烷排放量、瘤胃古菌的物种多样性及丰度都无显著影响(P0.05)。这些结果表明Methanobrevibacter ruminantium Ml的膜蛋白EhaF不是一种产甲烷菌广谱抗原。 【关键词】：重组蛋白EhaF 山羊 高通量测序 瘤胃古菌 产甲烷菌
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 符号说明9-14
• 引言14-15
• 第一章 文献综述15-25
• 1. 瘤胃甲烷排放及调控措施15-19
• 1.1 瘤胃产甲烷菌15
• 1.2 瘤胃甲烷产生途径15
• 1.3 瘤胃甲烷减排的调控措施15-19
• 1.3.1 调控日粮结构16
• 1.3.2 添加有机酸16
• 1.3.3 添加脂质16-17
• 1.3.4 使用添加剂17
• 1.3.5 免疫调控17-19
• 2. 产甲烷重组蛋白疫苗19-21
• 2.1 反向疫苗学19
• 2.2 产甲烷菌广谱抗原基因的筛选19-20
• 2.3 EhaF20-21
• 3. 高通量测序在瘤胃产甲烷菌研究上的应用21-24
• 3.1 Roche GS FLX+system22
• 3.2 Ion Torrent PGM22
• 3.3 Miseq测序的Illumina22-24
• 4 存在的问题及本研究的目的意义24-25
• 4.1 存在的问题24
• 4.2 本研究的目的及意义24-25
• 第二章：试验研究25-58
• 试验一：重组蛋白的异源表达及纯化、鉴定25-39
• 1. 材料25
• 1.1 试验材料25
• 1.1.1 目的基因：mru140725
• 1.1.2 菌株及载体25
• 1.2 主要仪器和设备25
• 1.3 生物信息软件25
• 1.4 试剂25
• 2. 试验方法25-31
• 2.1 目的基因克隆及重组质粒的构建25-29
• 2.1.1 引物设计25-26
• 2.1.2 PCR扩增目的基因26
• 2.1.3 PCR产物回收26-27
• 2.1.4 PCR产物及pET30a(+)双酶切27
• 2.1.5 酶切产物胶回收及产物连接27-28
• 2.1.6 大肠杆菌Top10感受态的制备28-29
• 2.1.7 连接产物转化29
• 2.1.8 阳性克隆鉴定29
• 2.2 表达菌株的构建29-30
• 2.2.1 大肠杆菌Rosetta感受态的制备29
• 2.2.2 阳性克隆子及空载的转化及鉴定29-30
• 2.3 重组质粒在ROSETTA的表达30-31
• 2.3.1 小规模重组质粒表达30
• 2.3.2 重组蛋白EhaF的纯化30
• 2.3.3 重组蛋白SDS-PAGE条带的质谱分析30-31
• 2.3.4 大规模重组质粒表达31
• 3. 结果31-37
• 3.1 重组质粒的构建31-32
• 3.2 重组质粒PET30A(+)·MRU1407的表达32-35
• 3.3 重组蛋白的纯化及鉴定35-37
• 4. 讨论37-38
• 4.1 表达载体的构建及蛋白的表达37-38
• 4.2 蛋白的纯化及鉴定38
• 5. 小结38-39
• 试验二：重组蛋白EhaF免疫山羊及免疫效果评价39-58
• 1. 材料39-40
• 1.1 试验材料39
• 1.1.1 重组蛋白EhaF39
• 1.1.2 试验动物39
• 1.2 试验日粮39
• 1.3 主要仪器和设备39-40
• 1.4 试剂40
• 1.5 生物信息学分析软件及数据库40
• 2. 方法40-45
• 2.1 重组蛋白EhaF免疫山羊40-41
• 2.1.1 试验准备40
• 2.1.2 免疫程序及采样时间40
• 2.1.3 样品采集方法40-41
• 2.2 抗体滴度检测41-42
• 2.3 甲烷排放量检测42
• 2.4 提取瘤胃微生物总DNA42-43
• 2.5 Miseq测序43-44
• 2.6 数据分析44-45
• 3. 结果45-53
• 3.1 血液指标45-46
• 3.2 清、唾液及瘤胃液抗体滴度46-47
• 3.3 甲烷排放量47-48
• 3.4 Miseq测序48-53
• 3.4.1 稀释曲线48-49
• 3.4.2 物种注释49-52
• 3.4.3 Alpha多样性52-53
• 3.4.4 产甲烷菌属丰度的比对53
• 4. 讨论53-57
• 4.1 血液生化指标及血常规53-54
• 4.2 血清、唾液瘤胃液抗体滴度54-55
• 4.3 甲烷排放量55
• 4.4 稀释曲线55
• 4.5 物种注释55-56
• 4.6 Alpha多样性56-57
• 4.7 产甲烷菌丰度的对比57
• 5. 小结57-58
• 第三章：结论及创新点58-59
• 1. 结论58
• 2. 创新点58
• 3. 需进一步研究的问题58-59
• 参考文献59-66
• 致谢66

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