二氯甲烷降解菌的分离鉴定、降解特性及关键酶基因克隆与表达研究

【摘要】： 本文通过选择性富集培养,从长期被卤代脂肪烃污染的废水和活性污泥中分离纯化二氯甲烷高效降解菌,并对所分离菌株进行生化鉴定以及16S rDNA系统发育研究,进一步开展了降解特性、关键酶基因克隆与表达方面的研究,以期为探索微生物对异型生物质(Xenobiotics)的转化与降解机理、典型有机污染物的生物处理、污染环境的生物修复提供创新的技术支持与方法论指导。 本研究获得的主要结论如下: 1.从废水和活性污泥中分离筛选得到2株二氯甲烷降解菌株,分别命名为WZ-12和wh22菌株。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验、碳源利用试验(Biolog)、全细胞脂肪酸分析、G+C mol%含量分析以及16S rDNA序列同源性分析,证明WZ-12和wh22菌株应分别属于芽孢杆菌属及梭杆菌属。其中WZ-12菌株被鉴定为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的又一菌株;推测菌株wh22应当是梭形杆菌(Lysinibacillus sphaericus)的又一菌株,首次发现了环状芽孢杆菌菌株和梭形杆菌菌株具有二氯甲烷降解活性。 2.WZ-12和wh22两株菌都有较宽的温度、pH及二氯甲烷底物浓度适应范围。在菌体生长最适的pH环境中,菌株对二氯甲烷的降解效率也最高;在30℃、初始pH6.0的MM培养基中,WZ-12菌株72 h对二氯甲烷的降解效率达85.23%。而wh22菌株在37℃、初始pH6.0的MM培养基中48 h的降解效率约80.09%。有机物的加入可使降解菌WZ-12对二氯甲烷的降解加速,其中酵母膏及葡萄糖效果优于蛋白胨。有机物的加入对wh22菌株的降解能力影响不大;WZ-12和wh22菌株会因二氯甲烷浓度增加而产生抑制,降解率下降,符合非线性的高姆比兹模型。菌株WZ-12能适应高盐浓度生长,NaCl浓度在10-60 g L~(-1)范围生长良好,对CH_2Cl_2、CH_2BrCl、C_2H_2Cl_2和C_2H_4Cl_2均有降解能力,72 h降解效率分别为78.28%、58.19%、60.32%和45.08%。 3.菌株wh22含有1个降解性质粒,分子量为48.8 kb,命名为pRC11。初步建立了质粒pRC11的物理图谱。该质粒还是一个汞盐抗性质粒,可在不同种属菌株之间转移,以E.coli DH5(dcm~-)作为受体菌做质粒的接合转移试验,阳性转化子的转化频率为1.65×10~5/μg of plasmid DNA。 4.通过设计基于二次多项式数学模型,对试验结果进行多元回归分析,得到了如下适用于DCM降解率预测的经验关联式回归模型: 采用响应面分析法,在摇瓶水平上,得到了菌株WZ-12生物降解工艺的最优条件为:DCM初始浓度380 mg/L(X_1)、葡萄糖添加浓度13.72 mg/L(X_2)、H_2O_2添加浓度115 mg/L(X_3)。在此条件下,预测得到的最大降解率为93.18%。对以上获得的最佳工艺参数进行摇床水平上的降解率试验验证,得到好氧降解率平均值为92.88±0.27%,与模型预测值(93.18%)吻合较好,该降解率回归模型为菌株WZ-12在生物法处理含DCM废气的应用有一定的指导意义。 5.对来自菌株WZ-12的脱卤素酶进行了分离纯化和酶学性质研究,获得二氯甲烷脱卤素酶,纯酶分子量为31 kDa,比酶活提高了8.27倍,得率为34.83%,纯化倍数为8.27。该酶为诱导酶,最佳产酶温度为30℃,粗酶液在50℃以下具备一定的耐热性能和稳定性,最佳产酶pH为6.5;该酶在pH5-7之间稳定较好,但当pH大于7或小于5时,稳定性急剧下降。Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶活有增强作用,而Cu~(2+)、Zn~(2+)和Ba~(2+)则抑制酶活性,Hg~(2+)对酶活性抑制影响最大。 该脱卤素酶表观Km值在30℃(pH7.0)为5.25×10~(-3)mol/L,Vmax为3.67×10~(-4)mol/L·min,K_(cat)为6.97×10~4S~(-1)。该酶的底物特异性不高,可以催化CH_2Cl_2、CH_2Br_2、CH_2I_2和CH_2BrCl脱卤。 6.从菌株WZ-12中克隆得到二氯甲烷脱卤素酶基因dcmR,并对克隆产物进行了Southern杂交鉴定。dcmR编码基因序列为864 bp,编码脱卤素酶蛋白大小为288个氨基酸残基,预测分子量32±1 kDa。BLAST比对结果显示,克隆的基因片段与Methylobacterium sp.DM4的二氯甲烷脱卤酶基因序列同源性达98.6%。蛋白的氨基末端约20-80 aa与GST有类似的结构域,中间约第50位-80位aa间具有多个跟GSH的结合位点有关的超二级结构模体结构域。将所得到的菌株相关基因序列用SEQUIN软件上传至GenBank,得到序列登录号FJ405230。 7.通过构建具T7强启动子的pET高效表达载体(pET21a和pET15b),转化E coli(DE3)RP,构建了二氯甲烷脱卤酶的原核表达系统。构建了3种表达载体,pET-21a-dcmR(no-tag)不含任何标签,其转化子的二氯甲烷脱卤素酶酶活(21.95U·mL~(-1))高于原始菌株WZ-12(14.26U·mL~(-1)),可直接用于二氯甲烷生物降解的工程应用研究;pET-21a- dcmR with his-tag引入了6个组氨酸残基“标签”(His-tag),为后续酶蛋白分离纯化获得纯化酶的研究非常有意义;pET-15b-dcmRwith his-tag and LVPRGS thrombin在引入6个组氨酸残基“标签"(His-tag)的同时,增加了凝血酶酶切位点,方便了His-tag的切除。将3种原核表达载体转化E.coli(DE3)RP并诱导表达,得到了具有酶活性的融合蛋白。 8.探讨重组酶的表达特点和部分酶学性质。重组菌经IPTG诱导后,细菌总蛋白表达量为0.76g/L,其中融合蛋白占总蛋白的32.00%,酶活最高达25.78U/mL,酶的比活为88.86 U/mg蛋白。重组菌周质中酶活2.92 U/mL,胞内酶活22.86 U/mL。重组菌产生的酶活力与比活较原降解菌株高1-2倍。利用融合蛋白N末端的His-tag,经金属螯合亲和层析纯化后,得到了纯度较高的融合酶蛋白,酶蛋白的得率为72%,比活为144.73 U/mg。凝血酶切除His-tag后,经SDS-PAGE测定,重组蛋白的分子量为33±1 kDa,与理论计算值34 kDa相符。重组的二氯甲烷脱卤素酶在pH 6.5,温度30℃有最大相对酶活。但重组的二氯甲烷脱卤素酶对温度和pH要敏感。最后,对重组菌的生长特性和降解特性的研究表明,重组菌在LB培养基中的生长特性与原始菌株没有差别,生长至对数期A_(600nm)值都可达到2.4左右。重组菌株dcmR-1在25 h的降解率达90%以上,降解效率比原降解菌株有明显提高。 【关键词】：二氯甲烷 生物降解 二氯甲烷脱卤素酶 基因克隆与表达
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：Q93
【目录】：

• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-17
• 第一章 绪论17-58
• 1.1 二氯甲烷的分布和对环境的影响17-28
• 1.1.1 卤代烃与二氯甲烷17-21
• 1.1.2 二氯甲烷在环境中的累积21-26
• 1.1.3 二氯甲烷的危害26-28
• 1.2 微生物的脱氯机制28-35
• 1.2.1 有机卤化物作为碳源和能量的唯一来源29-30
• 1.2.2 微生物对有机氯化物脱氯方式举例30-35
• 1.3 二氯甲烷生物降解菌35-38
• 1.3.1 氯代脂肪烃降解菌35-36
• 1.3.2 二氯甲烷降解菌36-38
• 1.4 二氯甲烷脱卤素酶38-45
• 1.4.1 脱卤酶的生化和分子特征38-40
• 1.4.2 二氯甲烷脱卤素酶的一般性质40-42
• 1.4.3 二氯甲烷脱卤素酶核甘酸序列和二级结构42-43
• 1.4.4 二氯甲烷脱卤素酶的三维结构43-45
• 1.5 二氯甲烷生物降解关键酶的分子生物学研究45-46
• 1.6 二氯甲烷脱卤素酶和GSH-S-转移酶的进化关系46-48
• 1.7 二氯甲烷脱卤素酶基因表达的调控48-50
• 1.8 二氯甲烷的生物净化原理与工艺50-55
• 1.8.1 生物法净化二氯甲烷机理50-51
• 1.8.2 生物法净化二氯甲烷工艺51-55
• 1.9 本研究的工作基础、目的、意义和主要内容55-58
• 1.9.1 本研究的工作基础55
• 1.9.2 本研究的目的和选题意义55-56
• 1.9.3 本研究的主要内容56-58
• 第二章 二氯甲烷降解菌株分离、鉴定及系统发育研究58-87
• 2.1 材料与方法58-69
• 2.1.1 材料与培养基58-59
• 2.1.2 试剂和仪器59
• 2.1.3 检测方法59-60
• 2.1.4 二氯甲烷降解菌株分离与降解能力初筛60-61
• 2.1.5 降解菌株的鉴定及系统发育研究61-69
• 2.2 结果与讨论69-84
• 2.2.1 菌株的驯化与筛选69-71
• 2.2.2 分离菌株的降解能力71-72
• 2.2.3 分离菌株的鉴定结果72-77
• 2.2.4 分离菌株的16S rDNA序列分析77-83
• 2.2.5 基于16S rDNA序列系统发育树的构建83-84
• 2.3 小结84-87
• 第三章 二氯甲烷降解菌株生长和降解特性研究87-105
• 3.1 材料与方法87-92
• 3.1.1 二氯甲烷降解菌株生长条件研究87-88
• 3.1.2 分离菌株降解特性研究88-89
• 3.1.3 高盐浓度下菌株WZ-12降解二氯甲烷特性89-90
• 3.1.4 二氯甲烷降解率的测定90
• 3.1.5 菌株wh22降解性质粒特性研究90-92
• 3.2 结果与讨论92-104
• 3.2.1 二氯甲烷降解菌的生长条件92-94
• 3.2.2 分离菌株降解特性研究94-98
• 3.2.3 高盐浓度下菌株WZ-12降解二氯甲烷特性98-100
• 3.2.4 菌株wh22降解性质粒特性研究100-104
• 3.3 小结104-105
• 第四章 二氯甲烷生物降解工艺条件的优化105-117
• 4.1 材料与方法105-108
• 4.1.1 菌株和培养基105-106
• 4.1.2 最佳降解条件的选择106
• 4.1.3 摇瓶水平生物降解试验106
• 4.1.4 二氯甲烷的测定106-107
• 4.1.5 试验设计与分析107-108
• 4.2 结果与讨论108-115
• 4.2.1 最佳降解条件108-109
• 4.2.2 试验设计109
• 4.2.3 摇瓶生物降解试验109-111
• 4.2.4 响应面法优化DCM好氧降解工艺111-115
• 4.2.5 对降解率回归模型的实验验证115
• 4.3 小结115-117
• 第五章 二氯甲烷脱卤酶的分离纯化及酶学性质研究117-133
• 5.1 材料与方法117-121
• 5.1.1 主要仪器与试剂117-118
• 5.1.2 菌种及培养条件118
• 5.1.3 实验方法118-120
• 5.1.4 酶学性质120-121
• 5.2 结果与讨论121-131
• 5.2.1 酶的分离纯化121-126
• 5.2.2 产酶和酶学性质研究126-131
• 5.3 小结131-133
• 第六章 二氯甲烷脱卤酶的基因克隆与鉴定133-158
• 6.1 材料与方法133-144
• 6.1.1 菌株、载体和试剂盒133-135
• 6.1.2 试剂和培养基135-136
• 6.1.3 引物设计136-137
• 6.1.4 仪器与DNA分析软件137
• 6.1.5 试验设计与方法137-142
• 6.1.6 序列测定与系统发育分析142-143
• 6.1.7 同位素标记探针制备143
• 6.1.8 Southern分子杂交143-144
• 6.2 结果与讨论144-156
• 6.2.1 提取的细菌基因组的浓度144-145
• 6.2.2 PCR扩增dcmR基因145
• 6.2.3 克隆载体pUC57构建与鉴定145-146
• 6.2.4 表达载体的构建与酶切鉴定146-147
• 6.2.5 目的基因的鉴定147-156
• 6.3 小结156-158
• 第七章 二氯甲烷脱卤素酶基因在大肠杆菌中的表达158-178
• 7.1 材料与方法158-168
• 7.1.1 菌株、载体和工具酶158-160
• 7.1.2 试剂和培养基160
• 7.1.3 引物分析设计160-161
• 7.1.4 目的基因片断的PCR扩增与克隆161-162
• 7.1.5 表达质粒的构建与转化162-167
• 7.1.6 目的基因dcmR在大肠杆菌中诱导表达167
• 7.1.7 重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳167
• 7.1.8 表达产物的活性分析167-168
• 7.2 结果与讨论168-177
• 7.2.1 重组表达载体的阳性克隆检测168-170
• 7.2.2 重组表达载体的酶切鉴定结果170-172
• 7.2.3 dcmR基因在大肠杆菌中的高效表达172-176
• 7.2.4 表达产物二氯甲烷脱卤素酶酶活检测176-177
• 7.3 小结177-178
• 第八章 重组菌及其二氯甲烷脱卤素酶的研究178-189
• 8.1 材料与方法178-180
• 8.1.1 菌株、载体和工具酶178
• 8.1.2 试剂和培养基178
• 8.1.3 重组子诱导表达条件优化178-179
• 8.1.4 二氯甲烷降解率的测定179
• 8.1.5 脱卤素酶的活力测定179
• 8.1.6 融合蛋白的纯化和坚定179-180
• 8.1.7 融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳180
• 8.1.8 重组酶的酶学性质180
• 8.2 结果与讨论180-187
• 8.2.1 重组菌株和宿主菌E.coli BL21(DE3)的生长特性比较180-181
• 8.2.2 重组菌株和B.circulans WZ-12对CH_2Cl_2降解特性的比较181-182
• 8.2.3 表达初检验182-183
• 8.2.4 诱导表达与电泳检测183-184
• 8.2.5 重组酶的性质184-187
• 8.3 小结187-189
• 第九章 结论与展望189-193
• 9.1 本论文主要结论189-191
• 9.2 论文创新点191-192
• 9.3 本文工作的不足及对今后工作的展望192-193
• 博士研究生学习期间发表的主要学术论文193-194
• 致谢194-195
• 参考文献195-207

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以自主创新技术 锻造产业优势链    季诚建

卤素为人类打开一扇窗    牛水钻;

L-薄荷基氯甲烷的合成研究    阳年发;张祚;欧阳歆;

科技成果产业化潜力无穷——获2001年杭州市科技进步奖的一等奖项目简介    

直接法合成甲基氯硅烷    

论某些取代三芳基卤甲烷与二烷基亚磷酸盐的相互作用    张景龄

氯甲烷源汇分布、自然生产与生态调节:研究概述    王进欣;

氯甲烷加压法合成甲胺磷    王国杰;彭顺跃;

急性氯甲烷中毒27例临床分析    何凤云;张晓纲;何成一;王春友;

环境风险评价在环境影响评价中的应用    田野;赵文喜;

有机硅生产线节能技术的应用    张亚娣;戴永琴;

一步法合成烯丙基聚氧化乙烯-氧化丙烯甲醚    黎松;汤四清;尹艳洪;宋晓文;

成功救治特大面积烧伤患者一例    贲道锋;夏照帆;郇京宁;任家骠;

高效除草剂草丁膦中间体MeP(OEt)_2的合成    史鸿鑫;林辉;项菊萍;雷小明;徐春柳;吴蕾;

煤制甲醇项目简介    

国内甲基氯硅烷合成工艺的比较    周遵石;鲁建春;杨雨富;王刚;金美仙;王福民;

三农公司实现氯甲烷回收    记者 罗阿华

膜法回收氯甲烷装置研制成功    仲化

二甲基二氯硅烷接近国际先进水平    记者 杨扬

五通桥区在全省率先过关    朱斌袁葛强 记者 余向华

新安化工打官司直指侵权泛滥    翁国娟

新安化工打官司直指侵权泛滥    翁国娟

福华集团：草甘滕项目试生产    钟继华 特约通讯员 袁葛强

让化工产业与园林城市协调发展    本报记者 赵智钢钟华林 薛志伟

自主创新破除垄断坚冰    刘群

新安化工的循环经济之路    郏海燕

分子筛催化转化氯甲烷制取低碳烯烃及其反应机理的研究    张大治

中国东部陆架海区溴甲烷和氯甲烷的浓度分布和海—气通量研究    陆小兰

阈值光电子—光离子符合速度成像及其应用研究    唐小锋

气—固相法合成氯甲烷技术研究    唐雨东

氯甲烷尾气深度回收方法的比较与优化    康志鹏

草甘膦副产氯甲烷回收工艺的开发    翁路平

用离子交换树脂去除三甘醇中氯离子工艺研究    王亭

丁基橡胶装置氯甲烷脱水新工艺    王冰

氯甲烷回收过程的建模与分析    吴国权

膜法回收有机硅尾气中氯甲烷流程设计与优化    冯宏超

草甘膦及副产氯甲烷回收新工艺研究    任不凡

东海和黄海中氯甲烷和溴甲烷的分布与海—气通量研究    宋贵生

甲烷液相氧化反应产物处理工艺的研究    虎锐