壳聚糖与纤维素酶对瘤胃发酵、甲烷产生及微生物区系的影响

【摘要】：反刍动物甲烷的产生，是饲粮能量损失的一部分，同时也会对环境造成影响。目前有许多关于甲烷减排的措施，但有些措施涉及到抗生素残留或饲料消化率降低问题，有必要探讨一种在不影响饲料消化率的前提下，降低甲烷的产生。本研究通过体外发酵试验，研究壳聚糖和外源纤维素酶对瘤胃发酵、甲烷产生及微生物区系的影响，旨在探讨壳聚糖和纤维素酶调控瘤胃代谢的机理，为壳聚糖和纤维素酶在生产实践中应用提供理论依据。 试验一添加壳聚糖对瘤胃发酵、甲烷产生及微生物区系的影响。试验采用体外发酵试验，3×4因子设计，试验因素分别为精粗比（20:80、50:50和80:20）和壳聚糖水平（0、40、80和120mg/g DM底物）。结果显示，在三种精粗比条件下，壳聚糖均显著提高瘤胃pH（P0.05），且随壳聚糖添加水平的增加而上升；添加壳聚糖减少总产气量和甲烷产生，降低体外干物质消失率（IVDMD）和纤维素酶活（P0.05）。精粗比20:80和50:50时，添加壳聚糖显著增加丙酸摩尔比例（P0.01），降低乙丙比（P0.05），而对乙酸、丁酸的摩尔比例无影响，对总挥发性脂肪酸（VFA）浓度和氨态氮浓度无影响（P0.05）。精粗比80:20时，添加壳聚糖显著增加瘤胃氨态氮浓度、丁酸、戊酸和支链挥发性脂肪酸（BCVFA）摩尔比例（P0.05），降低乙酸摩尔比例（P0.05），而对丙酸摩尔比例无影响（P0.05）。壳聚糖显著增加产琥珀酸丝状杆菌的数量（P0.05），但对总细菌、原虫和厌氧真菌无影响。研究表明，添加壳聚糖减少甲烷的产生，提高丙酸摩尔比例，降低乙丙比，使瘤胃维持一个较高水平的pH，且壳聚糖对瘤胃发酵模式的作用效果受发酵底物精粗比的影响。 试验二外源纤维素酶对瘤胃发酵、干物质降解率和微生物区系的影响。本试验研究三种精粗比（20:80、50:50和80:20）饲粮条件下，添加外源纤维素酶对瘤胃发酵的影响，四个纤维素酶添加水平（0、40、80和120U/g DM）。结果显示，发酵24h后，纤维素酶显著增加总产气量、甲烷产生量、IVDMD和总VFA浓度（P0.05），降低瘤胃液pH（P0.05）。精粗比20:80和50:50饲粮中，纤维素酶增加丙酸的摩尔比例（P0.05），降低乙丙比（P0.05），但在精粗比80:20饲粮条件下，没有发现类似的结果。精粗比20:80饲粮中，添加纤维素酶显著增加产琥珀酸丝状杆菌和甲烷菌的数量（P0.05），但在精粗比50:50和80:20饲粮中，添加纤维素酶对微生物区系的影响不显著。研究表明，纤维素酶提高干物质的降解率，改变瘤胃发酵的模式，对瘤胃发酵的作用效果受底物精粗比的影响。精粗比20:80和50:50的饲粮中添加纤维素酶作用效果比精粗比80:20时更明显。 试验三半纤维素酶对干物质降解率、瘤胃发酵和微生物区系的影响。本研究旨在探讨半纤维素酶对瘤胃发酵的影响，试验采用3×4双因素设计，三种精粗比（20:80、50:50和80:20）饲粮条件下，半纤维素酶添加分为四个水平（0、40、80和120U/g DM底物）。结果显示，发酵24h后，添加半纤维素酶显著增加IVDMD、总产气量和甲烷产生量（P0.05），降低瘤胃pH和NH3-N的浓度（P0.05）。添加半纤维素酶显著增加总VFA浓度（P0.05），不影响乙酸、丁酸和戊酸的摩尔比例（P0.05），但增加了丙酸的摩尔比例（P0.05），降低BCVFA摩尔比例和乙丙比（P0.05）。添加半纤维素酶降低了原虫数量（P0.05），增加了甲烷菌数量（P0.05），而对总细菌、产琥珀酸丝状杆菌和厌氧真菌无影响（P0.05）。研究表明，添加半纤维素酶提高IVDMD，增加总VFA浓度，改善了瘤胃发酵。 试验四壳聚糖与纤维素酶及其混合物对瘤胃发酵、甲烷产生及微生物区系的影响。本试验探讨壳聚糖、纤维素酶及其混合物对瘤胃发酵的影响，试验设计为：空白对照组，壳聚糖（80mg/g DM底物），纤维素酶（80U/g DM底物），混合物处理组（纤维素酶80U/g DM底物+壳聚糖80mg/g DM底物）。结果显示，发酵培养24h后，纤维素酶处理组和混合处理组显著增加总产气量、IVDMD和总VFA浓度（P0.05）。与纤维素酶处理组相比，混合处理组降低甲烷产生量、CH4/VFA和乙丙比（P0.05）。与对照处理组相比，壳聚糖处理组降低IVDMD、甲烷产生量和总VFA浓度（P0.05）。与其它三组相比，混合处理组具有较低的CH4/VFA和最低的乙丙比，并显著增加产琥珀酸丝状杆菌的数量（P0.05）。研究表明，混合处理组提高IVDMD，降低CH4/VFA，具有最高的丙酸摩尔比例，最低的乙丙比，有益于瘤胃发酵，比单独添加纤维素酶或壳聚糖，更能兼顾到瘤胃干物质降解率、甲烷的产生和瘤胃的发酵模式。各处理组对瘤胃发酵的影响依赖于饲粮的精粗比。 总之，饲粮中添加壳聚糖可减少甲烷的产生，改变瘤胃发酵模式；添加纤维素酶提高瘤胃中粗饲料的消化，促进瘤胃发酵；壳聚糖与纤维素酶配合使用，在不降低干物质消化率的前提下，减少甲烷的产生，更有益于瘤胃的发酵，提高能量的利用率。 【关键词】：壳聚糖 外源纤维素酶 瘤胃发酵 甲烷产生 瘤胃微生物
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S816
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 文献综述15-29
• 第一节 前言15-17
• 1.1.1 畜牧业对温室效应的影响15
• 1.1.2 壳聚糖在甲烷减排中的优点15
• 1.1.3 纤维素酶提高饲料消化率的重要性15-16
• 1.1.4 壳聚糖与纤维素酶的互补16
• 1.1.5 日粮精粗比对添加剂作用效果的影响16
• 1.1.6 本研究的目的和意义16-17
• 第二节 甲烷产生的机理及甲烷减排的策略17-20
• 1.2.1 瘤胃内甲烷的产生17
• 1.2.2 饲料添加剂在甲烷减排中的应用17-20
• 第三节 壳聚糖的生物学特性及其在畜牧业中的应用20-24
• 1.3.1 壳聚糖的结构及理化特性20
• 1.3.2 壳聚糖的生物学特性20-21
• 1.3.3 壳聚糖的抑菌作用21-22
• 1.3.4 壳聚糖在畜牧生产中的应用研究22-24
• 第四节 纤维素酶降解粗纤维的机理及其在畜牧业生产中的应用24-27
• 1.4.1 纤维素酶降解粗纤维，提高消化率的作用机理24-25
• 1.4.2 纤维素酶在畜禽生产中的应用研究25-27
• 第五节 研究内容和技术路线27-29
• 1.5.1 研究内容27
• 1.5.2 技术路线27-29
• 第二章 不同精粗比饲粮中添加壳聚糖对瘤胃发酵、甲烷产生及微生物区系的影响29-42
• 2.1 材料与方法29-33
• 2.1.1 试验动物及材料29
• 2.1.2 缓冲液配制29-30
• 2.1.3 缓冲液制备30
• 2.1.4 试验方法30-31
• 2.1.5 测定指标及方法31
• 2.1.6 微生物 DNA 的提取31-32
• 2.1.7 实时定量 PCR 检测瘤胃微生物32-33
• 2.1.8 统计分析33
• 2.2 结果33-38
• 2.2.1 壳聚糖和饲粮精粗比对甲烷产生、总产气量和干物质消失率的影响33-34
• 2.2.2 壳聚糖和饲粮精粗比对瘤胃发酵参数的影响34-35
• 2.2.3 壳聚糖和饲粮精粗比对瘤胃挥发性脂肪酸的影响35-37
• 2.2.4 添加壳聚糖对瘤胃微生物区系的影响37-38
• 2.3 讨论38-41
• 2.3.1 壳聚糖对甲烷产生的影响38
• 2.3.2 壳聚糖对总产气量、体外干物质消失率和纤维素酶活的影响38-39
• 2.3.3 壳聚糖和饲粮精粗比对瘤胃 pH 的影响39
• 2.3.4 壳聚糖和饲粮精粗比对 VFA 的影响39-40
• 2.3.5 壳聚糖对瘤胃微生物区系的影响40-41
• 2.4 小结41-42
• 第三章 不同精粗比饲粮中添加纤维素酶对瘤胃发酵及微生物区系的影响42-51
• 3.1 材料与方法42-43
• 3.1.1 试验动物及材料42
• 3.1.2 缓冲液配制42
• 3.1.3 缓冲液制备42
• 3.1.4 发酵试验方法42-43
• 3.1.5 测定指标及方法43
• 3.1.6 微生物 DNA 的提取43
• 3.1.7 实时定量 PCR 检测瘤胃微生物43
• 3.1.8 统计分析43
• 3.2 结果43-48
• 3.2.1 纤维素酶和饲粮精粗比对总产气量、IVDMD、甲烷产生、CH_4/VFA、pH 和 NH_3-N 的影响43
• 3.2.2 纤维素酶和饲粮精粗比对挥发性脂肪酸的影响43
• 3.2.3 纤维素酶和饲粮精粗比对瘤胃微生物的影响43-48
• 3.3 讨论48-50
• 3.3.1 纤维素酶对总产气量和 IVDMD 的影响48
• 3.3.2 纤维素酶对 VFA 和 pH 的影响48-49
• 3.3.3 纤维素酶对甲烷产生和 NH3-N 浓度的影响49
• 3.3.4 纤维素酶对瘤胃微生物的影响49-50
• 3.4 小结50-51
• 第四章 不同精粗比饲粮中添加半纤维素酶对瘤胃发酵及微生物区系的影响51-60
• 4.1 材料与方法51-52
• 4.1.1 试验动物及材料51-52
• 4.1.2 缓冲液配制52
• 4.1.3 缓冲液制备52
• 4.1.4 发酵试验方法52
• 4.1.5 测定指标及方法52
• 4.1.6 微生物 DNA 的提取52
• 4.1.7 实时定量 PCR 检测瘤胃微生物52
• 4.1.8 统计分析52
• 4.2 结果52-57
• 4.2.1 半纤维素酶和饲粮精粗比对瘤胃发酵参数、干物质消失率、酶活和 NH3-N 的影响52
• 4.2.2 半纤维素酶和饲粮精粗比对挥发性脂肪酸的影响52
• 4.2.3 半纤维素酶和饲粮精粗比对瘤胃微生物区系的影响52-57
• 4.3 讨论57-59
• 4.3.1 半纤维素酶对干物质消失率的影响57
• 4.3.2 半纤维素酶对甲烷产生的影响57
• 4.3.3 半纤维素酶对挥发性脂肪酸的影响57-58
• 4.3.4 半纤维素酶对瘤胃微生物区系的影响58-59
• 4.4 小结59-60
• 第五章 不同精粗比饲粮中添加壳聚糖和纤维素酶及其混合物对瘤胃发酵及微生物区系 的影响60-69
• 5.1 材料与方法60-61
• 5.1.1 试验动物及材料60
• 5.1.2 缓冲液配制60-61
• 5.1.3 缓冲液制备61
• 5.1.4 发酵试验方法61
• 5.1.5 测定指标及方法61
• 5.1.6 微生物 DNA 的提取61
• 5.1.7 实时定量 PCR 检测瘤胃微生物61
• 5.1.8 统计分析61
• 5.2 结果61-66
• 5.2.1 高粗料条件下添加壳聚糖、纤维素酶及其混合物对瘤胃发酵参数、IVDMD 和甲烷产生的影响61
• 5.2.2 中等精料条件下添加壳聚糖、纤维素酶及其混合物对瘤胃发酵参数、 IVDMD 和甲烷产生的影响61-66
• 5.2.3 高精饲粮条件下添加壳聚糖、纤维素酶及其混合物对瘤胃发酵参数、 IVDMD 和甲烷产生的影响66
• 5.2.4 壳聚糖、纤维素酶及其混合物对瘤胃微生物的影响66
• 5.3 讨论66-68
• 5.3.1 壳聚糖和纤维素酶及混合处理组对干物质消失率的影响66
• 5.3.2 壳聚糖和纤维素酶及混合处理组对挥发性脂肪酸的影响66-67
• 5.3.3 壳聚糖和纤维素酶及混合处理组对甲烷产生和 NH_3-N 浓度的影响67-68
• 5.3.4 壳聚糖和纤维素酶及混合处理组对瘤胃微生物菌群的影响68
• 5.4 小结68-69
• 第六章 结论69-70
• 本研究的主要结论69
• 本研究的创新点69
• 还需要进一步研究的内容69-70
• 参考文献70-85
• 附录85-88
• 缩略词表88-89
• 致谢89-90
• 作者简介90

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微生物发酵法生产纤维素酶    李收

一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及代谢产物的研究    李保深

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