长江河口湿地产甲烷菌及甲烷氧化菌的分子生态学研究

【摘要】：河口湿地是与全球甲烷排放相关的重要生态系统类型,深入理解其在全球甲烷循环过程中的作用对于认识全球温室气体的产生具有重要作用。目前,有关此类环境的净甲烷释放量的文献报道已有很多,但对甲烷相关微生物群落特征及其丰富度的研究却鲜见报道。本研究通过对湿地土壤因子的现场测定、相关微生物的第二代高通量测序(Next Generation Sequencing, GS FLX Titanium)和实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qPCR)分析等方法,对崇明岛东滩潮间带滩涂(无植被生长)和盐沼地(有植物生长)沉积物中产甲烷菌和甲烷氧化菌群落进行了分析。对产甲烷菌和甲烷氧化菌相关的甲基辅酶M还原酶基因(Methyl Coenzyme M Reductase A, mcrA)、甲烷氧化单加氧酶基因α亚基(Particulate Methane Monooxygenase,pmoA)和硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing Microorganisms, SRM)相关的异化硫酸盐还原酶基因B (Dissimilatory Sulfate Reductase B, dsrB)以及所有细菌和古生菌的16S rRNA基因进行研究以便全面了解甲烷循环相关的微生物群落特征。 滩涂沉积物中检测到大量产甲烷的微生物,包括一些未培养微生物类群,如ZC-I。然而Methanosarcinales和Methanomicrobiales在表层至100cm深的沉积物中是主要的类群。对不同深度沉积物中mcrA基因定量分析表明,产甲烷菌的丰富度随着深度的增加明显增高。滩涂沉积物中,产甲烷菌比硫酸盐还原菌丰富度更高,可能表明产甲烷菌群落在滩涂生化过程中发挥着重要作用。多样性指数结果表明：较深区域的产甲烷菌多样性较低。较深沉积物中产甲烷菌的较高丰富度和较低多样性可能因为深度对一些特殊的甲烷氧化菌类群具有选择性富集作用。氢营养的产甲烷菌类群,如Methanomicrobiales,竞争力虽不如硫酸盐还原菌,但是在硫酸盐水平较低的深层沉积物中其丰度却相对较高。因Methanosarcinales中含有一些能广泛利用底物的产甲烷菌类群,在表层沉积物中此类菌数量也较多。 崇明东滩盐沼地主要有芦苇(Phragmites australis)和互花米草(Spartina alterniflora)两种植物生长。芦苇是该区域的土著植物而互花米草则是当初为围垦造田人为引进的外来物种。目前,该地区的芦苇正在被互花米草侵略性地更替。对这两种植物的甲烷释放率测定结果表明,互花米草比芦苇的甲烷释放速率更高,进一步证实了有关互花米草具有更高甲烷释放通量的报道。这与互花米草的生物量密度、气体疏导能力以及互花米草对产甲烷菌具有促进作用等可能有密切的关系。底物促进产甲烷菌和硫酸盐还原菌的生长极可能是因为互花米草生长沉积物中总碳和总氮含量高于芦苇地,也可能与互花米草生长的沉积物中微生物可利用底物含量较高,能有效地促进微生物生长有关。互花米草的入侵在不同程度上影响了产甲烷菌和硫酸盐还原菌的群落多样性。互花米草生长的盐沼沉积物中产甲烷菌多样性小于芦苇生长的沉积物,互花米草对产甲烷菌群落可能具有一定的选择压力。互花米草盐沼沉积物中Methanomicrobiales群落的增加以及Methanococcales群落降低证实了这一结果。互花米草的入侵对硫酸盐还原菌没有表现出明显的影响。 甲烷的净释放通量是甲烷产生和被氧化相平衡的结果,我们对滩涂沉积物和盐沼沉积物中甲烷氧化菌群落进行检测。好氧甲烷氧化菌在滩涂沉积物和盐沼沉积物中的分布具有较大的差异。采用甲烷氧化单加氧酶α亚基pmoA基因保守的PCR引物(A189f/Mb661r)从滩涂沉积物中很难检测到甲烷氧化菌的存在,然而在盐沼沉积物中却很容易检测到。滩涂沉积物中无法检测到好氧甲烷氧化菌,可能是由于滩涂无植被生长,无法通过植物根系为土壤微环境提供氧气。该区域我们检测到了较高丰度的产甲烷菌,因此滩涂表层微氧区域极有可能存在甲烷氧化菌。当利用能同时覆盖氨氧化单加氧酶a亚基(Ammonia Monooxygenase, amoA)和甲烷氧化单加氧酶α亚基pmoA的高兼并引物可以检测到滩涂沉积物中存在与Crenothrix相关的微生物。Crenothrix是一种好氧的丝状甲烷氧化菌,携带有特殊的pmoA基因,很早前就有报道曾在水生环境中检测到它的存在。然而,我们发现在崇明东滩滩涂沉积物中Crenothrix丰度也很高。目前正在进行进一步实验研究其分布特征以及生理特性。虽然Crenothrix相关的甲烷氧化菌在滩涂沉积物中丰度较高,但常用的pmoA基因引物却无法覆盖这种甲烷氧化菌因而不能检测到。此外我们还采用了两组引物组合A189f/Mb661r (普通pmoA基因引物)和A414f/Mb616r(Crenothrix特异的引物)检测盐沼沉积物中好氧甲烷氧化菌的分布情况。结果表明,Crenothrix相关的pmoA基因在盐沼地沉积物中丰度较高,但常见的甲烷氧化菌类群丰度也很高。在盐沼沉积物中同时检测到了Ⅰ型和Ⅱ型的甲烷氧化菌,Methylosarcina、Methylomonas和Methylocystis是占主导的属。互花米草的入侵促进了甲烷氧化菌的丰度增加而对其多样性几乎没有产生影响。 本研究首次揭示了崇明东滩河口滩涂及盐沼沉积物中产甲烷菌和甲烷氧化菌群落结构及丰富度特性。还证实了互花米草入侵该河口湿地对甲烷循环相关微生物产生明显影响。 【关键词】：甲烷 产甲烷菌 甲烷氧化菌 东滩 长江河口湿地 互花米草 芦苇 滩涂 盐沼
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：Q933
【目录】：

• Abbreviations15-16
• 摘要16-19
• Summary19-22
• Chapter Ⅰ. Literature Review22-56
• 1.1 Methane as a Greenhouse Gas22
• 1.2 Sources and Sinks of Atmospheric Methane22-23
• 1.3 Estuarine Tidal Flats as Source of Atmospheric Methane23
• 1.4 Factors Affecting Methane Production and Emission in Estuarine wetlands23-25
• 1.5 Methane Producing and Oxidizing Microorganisms25-43
• 1.5.1 Phylogeny of methanogens and methanotrophs25-33
• 1.5.2 Ecology of methanogens and methanotrophs33-36
• 1.5.3 Marker genes of methanogens and methanotrophs36-38
• 1.5.4 Molecular techniques to study methanogens and methanotrophs38-43
• 1.6 Goals of the Study43
• 1.7 References43-56
• Chapter Ⅱ.Materials and Methods56-66
• 2.1 Description of the Study Sites56-57
• 2.2 In Situ Measurements and Sediment Sampling57-58
• 2.3 Chemical Analysis58-59
• 2.4 Molecular Analyses59-63
• 2.4.1 DNA extraction and PCR amplification59-60
• 2.4.2 Quantitative real-time PCR60-61
• 2.4.3 Design of the highly degenerated pmoA/amoA primer61-62
• 2.4.4 Amplification of pmoA and amoA genes from mudflat sediments62
• 2.4.5 Phylogeny and quantification of Crenothrix-related pmoA genes62-63
• 2.5 Attempts for enrichment of Crenothrix from the sediments63
• 2.6 Data analyses63-64
• 2.7 References64-66
• Chapter Ⅲ.Methyl Coenzyme M Reductase A(mcrA)-Gene basedInvestigation of Methanogens in Mudflat Sediments of Yangtze theRiver Estuary66-88
• 摘要66-67
• Abstract67-69
• 3.1 Sediment characteristics69-70
• 3.2 Quantification of mcrA and dsrB genes70-73
• 3.3 Analysis of the diversity of mcrA genes73-76
• 3.4 Phylogenetic analysis of mcrA gene sequences76-78
• 3.5 Depth-related distribution of major methanogenic lineages78-79
• 3.6 PCA and environmental cluster analyses79-80
• 3.7 Discussion80-83
• 3.8 Reference83-88
• Chapter Ⅳ.The Effect of Spartina alterniflora Invasion on theStructure of Methanogens and Sulfate-Reducing Microorganisms inEstuarine Marsh Sediments88-118
• 摘要88-89
• Abstract89-92
• 4.1 Methane flux rates and sediment characteristics92-94
• 4.2 Abundance of methanogens and SRM94-96
• 4.3 Diversity of methanogens and SRM96-99
• 4.4 Phylogenetic analysis of mcrA and dsrB OTUs99-103
• 4.5 Community distribution patterns with S.alterniflora invasion103-106
• 4.6 Comparison of communities at different stands106-109
• 4.7 Discussion109-112
• 4.8 References112-118
• Chapter Ⅴ.Abundance and Diversity of Aerobic Methanotrophs asa Function of Spartina alterniflora invasion in the Tidal Salt Marshof Dongtan118-136
• 摘要118-119
• Abstract119-122
• 5.1 Methane flux rates and sediment characteristics122
• 5.2 Abundance of methanotrophs122-123
• 5.3 Diversity of methanotrophs123-125
• 5.4 Phylogeny of pmoA OTUs125-127
• 5.5 Relative proportions of pmoA lineages with sampling stands127
• 5.6 PCA analysis127-129
• 5.7 Discussion129-131
• 5.8 References131-136
• Chapter Ⅵ.Crenothrix-Related pmoA Lineages are Abundant in theMudflat Sediments of Yangtze River Estuary136-149
• 摘要136-137
• Abstract137-139
• 6.1 Analysis of pmoA/amoA sequences in different samples139-141
• 6.2 Analysis of bacterial 16S rDNA sequences from mudflat sediments141-142
• 6.3 Phylogeny of Crenothrix in the mudflat sediments142-143
• 6.4 Quantification of Crenothrix-related pmoA genes143-146
• 6.5 Conclusion and continuing works on Crenothrix146-147
• 6.6 References147-149
• Overall Conclusion and Future Perspectives149-151
• Acknowledgements151-152
• Publication and Conference Presentation152-153
• 附录153-154

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