农村户用沼气池发酵微生物群落结构的分子解析

【摘要】： 随着人类社会的发展，能源短缺、环境污染问题日益突出，已严重威胁人类的生存和发展。沼气技术是解决我国农村能源危机和环境污染，实现农业可持续发展的有效途径。由于传统研究手段的限制，目前对沼气发酵微生物群落结构缺乏全面、准确的了解，从而阻碍了工程和工艺的改进进程，致使农村系统运行效率低和可控性差的问题难以解决。现代分子生态学技术在环境微生物研究中的成功应用，为突破这一技术瓶颈提供了新思路。本论文运用基于16S rDNA的克隆文库分析和DGGE指纹图谱分析等分子生态学技术，对农村户用沼气池发酵微生物的群落结构进行了解析。 首先通过对前人活性污泥的提取方法改进，建立了农村户用沼气池厌氧活性污泥总DNA的有效提取和纯化方法，DNA的得率、完整性、质量均可满足分子生态学研究的需要。 通过对PCR-DGGE条件的优化，建立了农村户用沼气池厌氧活性污泥微生物16S rDNA V3区PCR-DGGE分析体系：25μ1 PCR反应体系中，模板量为1ng；采用Touchdown PCR方式；DGGE胶变性剂浓度范围35％～56％；上样量为600ng，150V电泳270min，可较为准确地反映农村户用沼气池厌氧活性污泥微生物的多样性和群落组成。 分别构建了农村户用沼气池细菌和古菌的16S rDNA文库，通过文库分析，对农村户用沼气池发酵微生物的多样性进行了探索。结果表明，农村户用沼气池发酵系统微生物种类非常丰富，细菌比古菌表现出更为复杂的微生物多样性。不同微生物种群的丰度存在明显差异，有少数明显优势种群。其中的细菌，包括72个种群，大多数属于未培养菌，主要分属于五大类：低G+C革兰氏阳性菌(Firmicutes)、变形细菌(Protecobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、绿屈挠菌(Chloroflexi)和Genera-incertae-sedis-OP11。其中以低G+C革兰氏阳性菌为主，包含其2个亚类：梭菌(Clostridia)和芽孢杆菌(Bacilli)，占库容的54％，其次为拟杆菌占库容36％；其中的古菌，包括9个种群，都属于广古菌(Euryarchaeota)，包括甲烷鬃菌(Methanosaeta)、小甲烷粒菌(Methanocorpusculum)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)和甲烷盘菌(Methanoplanus)、甲烷囊菌(Methanoculleus)等，一分类地位不明确的Uncultured euryarchaeote和Methanocorpusculum parvum为优势种群。 利用PCR-DGGE指纹图谱分析技术对农村户用沼气池中正常池和酸化池的细菌和古菌微生物群落结构分别进行了比较，并进行动态跟踪监测。结果显示：两种沼气池中微生物种类都非常丰富，细菌比古菌表现出更为复杂的微生物多样性。不同微生物种群的丰度存在明显差异，有少数明显优势种群，这与16S rDNA克隆文库分析结论基本一致。正常池与酸化池的细菌群落结构存在明显差异，酸化池中梭菌(Clostridia)比重高，而拟杆菌(Bacteroidetes)相对较少；而两种池中古菌的群落结构非常相似。由此初步推断，影响农村户用沼气池发酵状况的可能主要是细菌，而不是古菌；不同时期，正常池和酸化池中细菌和古菌的多样性都基本稳定，但部分种群的丰度随着温度的变化有所改变，拟杆菌(Bacteroidetes)丰度的随发酵温度升高增加，而梭菌(Clostridial则相反。 本论文初步解析了农村户用沼气池发酵微生物的群落结构，为进一步优化群落结构、调节群落功能提供了科学依据，为实现我国农村沼气发酵的高效、可控运行奠定了基础。 【关键词】：农村户用沼气池 微生物群落结构 16S rDNA文库 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S216.4;S182
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 立题依据11-12
• 1.2 目的意义12
• 1.3 沼气发酵微生物研究进展12-16
• 1.3.1 沼气发酵微生物12-13
• 1.3.2 沼气发酵是多种微生物的协同作用13-15
• 1.3.3 传统研究方法的局限性15-16
• 1.4 微生物分子生态学技术研究进展16-23
• 1.4.1 克隆文库法16-17
• 1.4.2 变性梯度凝胶电泳技术17-18
• 1.4.3 单链构象多态性分析18
• 1.4.4 RAPD法18-19
• 1.4.5 实时荧光定量PCR19
• 1.4.6 rDNA的限制性内切酶消化分析19-20
• 1.4.7 末端限制片段长度多态性20
• 1.4.8 荧光原位杂交20-21
• 1.4.9 微生物放射技术21-22
• 1.4.10 分子生物学方法综合运用并与传统研究方法结合22-23
• 第二章 材料和方法23-33
• 2.1 实验材料23-26
• 2.1.1 厌氧活性污泥样品来源23
• 2.1.2 菌株23
• 2.1.3 培养基23
• 2.1.4 酶及相关生化试剂23-24
• 2.1.5 主要仪器24
• 2.1.6 溶液的配制24-25
• 2.1.7 引物合成与测序25-26
• 2.2 实验方法26-33
• 2.2.1 厌氧活性污泥总DNA提取和检测26-27
• 2.2.2 16S rDNA文库构建27-29
• 2.2.3 变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)29-33
• 第三章 农村户用沼气池发酵微生物DGGE分析方法的建立33-44
• 3.1 北京郊区某能源生态技术示范基地户用沼气池的调查情况33-34
• 3.2 厌氧活性污泥DNA提取方法和纯化34-36
• 3.2.1 农村户用沼气池厌氧活性污泥总DNA的提取34-35
• 3.2.2 农村户用沼气池厌氧活性污泥总DNA的纯化35-36
• 3.3 PCR扩增农村户用沼气池厌氧污泥微生物16S rDNA V3区36-38
• 3.3.1 细菌16S rDNA V3区扩增36-37
• 3.3.2 古菌16S rDNA V3区扩增37-38
• 3.4 细菌V3-PCR-DGGE方法的建立38-42
• 3.4.1 通过垂直DGGE确定水平DGGE变性剂浓度范围38-39
• 3.4.2 DGGE电泳时间优化39-40
• 3.4.3 DGGE上样量优化40
• 3.4.4 PCR模板量优化40-41
• 3.4.5 PCR扩增方式比选41-42
• 3.5 小结42
• 3.6 讨论42-44
• 第四章 农村户用沼气池发酵微生物多样性ARDRA分析44-58
• 4.1 材料和方法44
• 4.1.1 材料44
• 4.1.2 方法44
• 4.2 结果和分析44-57
• 4.2.1 厌氧活性污泥总DNA提取与纯化44-45
• 4.2.2 细菌16S rDNA文库的构建以及ARDRA分析45-53
• 4.2.3 古菌16S rDNA文库的构建以及ARDRA分析53-57
• 4.3 小结57-58
• 第五章 DGGE分析农村户用沼气池发酵微生物群落结构58-68
• 5.1 材料58
• 5.1.1 材料58
• 5.1.2 方法58
• 5.2 结果和分析58-66
• 5.2.1 DNA提取结果58-59
• 5.2.2 PCR-DGGE指纹图谱分析不同发酵状态沼气池细菌群落结构差异59-63
• 5.2.3 PCR-DGGE指纹图谱分析不同发酵状态沼气池古菌群落结构差异63-66
• 5.3 小结66
• 5.4 讨论66-68
• 全文总结68-69
• 参考文献69-77
• 硕士期间发表的论文77-78
• 致谢78

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