低温沼气发酵优良菌系的筛选及优势菌群分析

【摘要】：沼气是清洁能源之一，近几年，在政策激励和资金支持下，我国农村户用型沼气得到迅猛发展，然而人们对沼气发酵过程的控制还不完善，存在着沼气发酵启动时间长、原料利用率低、工艺控制不合理等问题，其中低温条件下产气质量低的问题是制约沼气事业发展的最重要因素之一。 由于沼气发酵涉及物料分解、产酸产氢和产甲烷等多种微生物，是一个非常复杂的厌氧消化过程，研究明确优良沼气发酵体系的菌群结构，发现优势菌群是挖掘利用优良微生物资源，指导沼气生产的关键。本研究以不同地区的沼泥为接种源，通过阶段降温模拟沼气发酵试验，筛选低温条件下产气性能优良的接种源。以低温沼气发酵性能不同的发酵菌系ZG2、CW1、HL2及对应的接种源ZGB、CWA、HLB作为试验材料，通过PCR-DGGE技术、基因克隆及测序技术，对沼泥中微生物菌群结构多样性进行了分析，研究结果如下： 1.从张家口沽源县，承德平泉县、围场县和邯郸临漳县采集低温下产气良好的沼泥样品12份：HLA、HLB、HLC、ZGA、ZGB、ZGC、CPA、CPB、CPC、CWA、CWB和CWC。以12份沼泥为接种源，进行了16°C、13°C、10°C和5°C五个温度阶段、为期40d的沼气发酵试验，通过总产气量、产气速率和甲烷含量三项指标的比较发现，以采自张家口沽源县的沼泥样品ZGB为接种源的5号处理组表现出最佳的低温沼气发酵性能，该处理组的沼气发酵总产气量为15910.4cm3，在10°C条件下，其产气速率达到0.048m3/（m3·d），甲烷含量为63%。 2.参试样品中的微生物多样性十分丰富，但由于沼气发酵的接种物、原料和发酵环境温度的不同，导致样品中微生物的菌群结构存在较大差异。样品中微生物的相似性系数同样表明，沼气发酵条件和环境的不同将导致发酵体系中微生物结构的多样性发生改变。 3.经基因克隆和测序比对，样品中主要的优势菌属为甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）、甲烷粒菌属（Methanocorpusculum）和甲烷鬃毛菌属（Methanosaeta）。 4. DGGE图谱中接种源ZGB和发酵菌系ZG2样品中的7号条带为甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）。此条带是ZGB和ZG2样品中唯一位置相同的条带，而其它样品在该水平位置处没有优势条带出现，推测甲烷八叠球菌是低温环境下维持沼气池正常产气的关键菌群。 【关键词】：沼气 低温 PCR-DGGE 产甲烷古菌 克隆
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S216.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 引言10-22
• 1.1 沼气研究与应用进展10-13
• 1.1.1 沼气发酵概念10
• 1.1.2 沼气发酵过程10-12
• 1.1.3 国外沼气应用进展12-13
• 1.1.4 国内沼气应用现状13
• 1.2 低温沼气技术研究进展13-14
• 1.2.1 合理的原料配比13-14
• 1.2.2 低温发酵添加剂14
• 1.2.3 沼气池保温和增温措施14
• 1.3 低温沼气微生物研究进展14-17
• 1.3.1 低温沼气微生物概述15-16
• 1.3.2 低温微生物的发酵机制16
• 1.3.3 传统分离培养方法16-17
• 1.3.4 现代分子生物学方法（非培养方法）17
• 1.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）17-20
• 1.4.1 技术原理18-19
• 1.4.2 PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的应用19
• 1.4.3 PCR-DGGE 技术常见问题19-20
• 1.4.4 PCR-DGGE 图谱分析20
• 1.5 本研究的目的和意义20-21
• 1.6 研究技术路线21-22
• 第二章 耐低温沼气发酵优势菌系的筛选22-29
• 2.1 试验材料22-23
• 2.1.1 活性沼泥样品的采集22
• 2.1.2 试验装置22-23
• 2.1.3 主要试剂和仪器23
• 2.2 试验方法23-25
• 2.2.1 沼气发酵试验23-24
• 2.2.2 沼气发酵产气量的测定24
• 2.2.3 甲烷含量检测24-25
• 2.2.4 数据分析25
• 2.3 结果与分析25-28
• 2.3.1 不同接种源对总产气量的影响25-26
• 2.3.2 不同接种源对产气速率的影响26-27
• 2.3.3 不同接种源对甲烷含量的影响27-28
• 2.4 讨论28
• 2.5 小结28-29
• 第三章 沼泥总 DNA 的提取及 PCR 扩增条件的优化29-41
• 3.1 试验材料29-30
• 3.1.1 沼泥样品29
• 3.1.2 试剂29
• 3.1.3 仪器设备29-30
• 3.2 试验方法30-35
• 3.2.1 Protein K-CTAB 提取法30
• 3.2.2 溶菌酶提取法30-31
• 3.2.3 试剂盒提取法31-32
• 3.2.4 总 DNA 的测定32
• 3.2.5 PCR 扩增条件的优化32-35
• 3.2.6 PCR 扩增产物检测35
• 3.3 结果与分析35-39
• 3.3.1 沼泥总 DNA 的提取35-36
• 3.3.2 古菌 16S rDNA 扩增条件的优化36-39
• 3.4 讨论39-40
• 3.5 小结40-41
• 第四章 沼泥微生物菌群多样性分析41-54
• 4.1 试验材料41
• 4.1.1 试剂41
• 4.1.2 主要仪器设备41
• 4.2 试验方法41-48
• 4.2.1 沼泥中微生物 DNA 的提取41
• 4.2.2 古菌 16S rDNA 片段扩增41-42
• 4.2.3 古菌 16S rDNA V3 区片段扩增42-43
• 4.2.4 PCR 扩增产物的回收43
• 4.2.5 DGGE 方法的建立43-46
• 4.2.6 DGGE 图谱分析46
• 4.2.7 DGGE 图谱条带回收46
• 4.2.8 回收条带基因的克隆及测序46-48
• 4.3 结果与分析48-53
• 4.3.1 沼泥总 DNA 的提取48
• 4.3.2 古菌 16S rDNA 片段扩增48-50
• 4.3.3 DGGE 条件优化结果50-51
• 4.3.4 DGGE 指纹图谱分析51-52
• 4.3.5 优势条带的克隆测序52-53
• 4.4 讨论53
• 4.5 小结53-54
• 第五章 结论54-55
• 参考文献55-60
• 附录 实验相关溶液及试剂配制方法60-62
• 硕士期间发表学术论文62-63
• 作者简介63-64
• 致谢64-65

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