降解纤维素产沼气菌群的研究及在食品剩余物中的应用

【摘要】：实验以不同环境的样品为研究对象,以无氧富集培养液和巨菌草为基质,对沼气发酵过程中沼气总产量、沼气日产量和沼气甲烷含量为指标,经过富集和组配筛选出一个能高效降解巨菌草产沼气的复合菌系。在发酵温度为37℃、接种量为5%、培养基为100 mL条件下发酵,经过40天发酵可以产生1219mL沼气,沼气中甲烷含量可以达到62%。与单一来源的菌种相比,组配的复合菌系产气启动快,酸化期缩短3-5天,甲烷化提前2-3天,稳定产气期持续时间长,能使整个发酵周期时间提前5-8天,产气量提高25%～50%。采用CTAB-NaCl法提取发酵不同阶段菌群的总DNA,分别用细菌和古菌的16S rDNA引物扩增其保守序列,将目的片段连接到pMD-18T载体,转化到感受态的大肠杆菌中,挑取经菌落PCR验证后的阳性克隆子外送检测。结果表明,90个细菌克隆子,其中25个属于Clostridium sp.、21个属于Treponema sp.、15个属于Eubacterium sp. 、8个属于Bacteriodetes sp.、2个属于Prevotella sp.、19个属于Uncultured,分别占菌群的27.8%、23.3%、16.7%、8.9%、2.2%、21.1%；84个古菌克隆子,其中38个属于Methanofollis sp.、22个属于Methanosarcina sp.、7个属于Methanobacterium sp.、2个属于Methanocorpusculum sp.、15个属于Uncultured,分别占菌群的45.2%、26.2%、8.3%、2.4%、17.9%,表明了发酵沼气菌群是一个复杂的菌系,沼气的产生是多种微生物共同作用的结果。采用SYBR Green荧光定量方法对不同阶段细菌和产甲烷菌的数量进行研究。结果表明,筛选的高产气菌群发酵前期,即发酵第10天时细菌的数量为2.0×109/mL,甲烷菌的数量为7.7×103/mL；发酵中期,即发酵第20天时细菌的数量为5.2×107/mL,甲烷菌的数量为1.7×104/mL；发酵后期,即发酵第30天时细菌的数量为7.7×107/mL,甲烷菌的数量为1.1×103/mL,菌群数量与发酵过程中的产气量有明显的对应关系。以组配的复合菌系为菌种,对甘蔗渣、废菇筒和笋头三种食品剩余物进行沼气发酵研究,三种原料均表现出很好的产气效果,30d发酵产气总量均在8L以上。从产气总量来看,笋头最高,废菇筒次之,甘蔗渣最低。从气体甲烷含量来看,废菇筒最高,笋头次之,甘蔗渣最低。 【关键词】：厌氧发酵 菌群结构 菌群数量 RT-PCR
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S216.4;TQ920.1
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 研究内容13-18
• 1.2.1 厌氧发酵三阶段原理13-14
• 1.2.2 沼气发酵的影响因素14-16
• 1.2.3 沼气发酵菌群的研究16-17
• 1.2.4 产甲烷菌17-18
• 1.3 国内外研究现状18-22
• 1.3.1 国内外沼气发酵技术研究进展18-19
• 1.3.2 沼气发酵菌群的分子生物学研究进展19-22
• 第二章 高产沼气菌群的筛选及构建22-32
• 2.1 实验材料与设备22-23
• 2.1.1 样品采集22
• 2.1.2 主要仪器22
• 2.1.3 主要试剂22-23
• 2.1.4 发酵原料23
• 2.2 实验方法23-25
• 2.2.1 样品采集及处理23
• 2.2.2 富集培养基的配制23-24
• 2.2.3 高产气菌群的构建24
• 2.2.4 分析项目及方法24-25
• 2.3 结果与分析25-31
• 2.3.1 菌种富集25-29
• 2.3.2 高产气菌群的构建29-31
• 2.4 总结31-32
• 第三章 发酵过程不同阶段菌群种类的分析32-48
• 3.1 实验材料32-35
• 3.1.1 实验样品32
• 3.1.2 菌株与质粒32
• 3.1.3 扩增引物32-33
• 3.1.4 分析软件33
• 3.1.5 主要试剂33
• 3.1.6 主要仪器33-34
• 3.1.7 主要溶液与培养基的配制34-35
• 3.2 实验方法35-38
• 3.2.1 菌群DNA的提取35
• 3.2.2 16S rDNA基因的PCR扩增35-36
• 3.2.3 目的DNA片段的回收36
• 3.2.4 连接反应36
• 3.2.5 化学感受态细胞的制备36-37
• 3.2.6 质粒转化37
• 3.2.7 菌落PCR选取阳性克隆37
• 3.2.8 菌群鉴定及结构分析37-38
• 3.3 结果与分析38-46
• 3.3.1 各阶段菌群16S rDNA文库构建38-40
• 3.3.2 发酵各阶段细菌系统进化树及菌群种类40-43
• 3.3.3 发酵各阶段古菌系统进化树及菌群种类43-46
• 3.4. 总结46-48
• 第四章 发酵过程不同阶段菌群数量的分析48-61
• 4.1 实验材料48
• 4.1.1 样品采集及样品总DNA的提取48
• 4.1.2 主要试剂和仪器48
• 4.2 实验方法48-51
• 4.2.1 引物设计48-49
• 4.2.2 标准质粒的构建49-50
• 4.2.3 荧光定量PCR扩增曲线的建立50
• 4.2.4 标准曲线的建立50-51
• 4.2.5 熔解曲线分析51
• 4.2.6 菌数量的计算51
• 4.3 结果与分析51-59
• 4.3.1 标准质粒的构建51-53
• 4.3.2 扩增曲线的建立53-55
• 4.3.3 标准曲线的建立55-56
• 4.3.4 熔解曲线分析56-58
• 4.3.5 菌数量的计算58-59
• 4.4 总结59-61
• 第五章 高产沼气菌群在食品剩余物中的应用61-65
• 5.1 实验材料与设备61
• 5.1.1 接种物61
• 5.1.2 实验原料61
• 5.1.3 实验设备61
• 5.2 实验方法61-62
• 5.3 结果与分析62-64
• 5.3.1 不同原料产气总量62-63
• 5.3.2 不同原料产沼气甲烷含量63-64
• 5.4 总结64-65
• 第六章 结论与展望65-68
• 6.1 结论65-66
• 6.2 不足与展望66-68
• 参考文献68-74
• 致谢74

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