沼气发酵微生物区系变化及产甲烷古菌群落结构分析

【摘要】： 准确、全面地了解沼气发酵池中微生物群落,尤其是产甲烷古菌群落的结构和变化规律,能为沼气发酵过程优化设计、沼气发酵微生物的代谢调控和沼气发酵菌剂的开发等提供系统的微生物学基础参数。本文综合应用传统微生物学、现代分子生态学和分子生物学技术,采用MPN(most probable number)计数分析以及基于PCR的16S rDNA克隆文库分析和DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)指纹图谱分析等研究方法,对沼气发酵池中微生物群落区系的多样性及其变化规律和其中产甲烷古菌群落结构进行分析。 经MPN计数分析,两口正常沼气池中发酵性细菌为9.5×107个/mL和2.5×106个/mL,厌氧纤维素分解菌均为9.5×10个/mL,产甲烷古菌为4.5×106个/mL和2.5×107个/mL,硫酸盐还原菌为4.5×105个/mL和1.5×105个/mL。经克隆文库分析,沼气池中细菌以未培养细菌(uncultured bacteria)为主,还有梭菌目(clostridiales)、互养菌属(syntrophus)和γ-变形菌纲(gamma proteobacterium)细菌等类群,部分序列与GenBank中所公布序列的相似性较低(95%);古菌全是产甲烷古菌,以甲烷粒菌属(methanocorpusculum)为主,其他类群包括甲烷袋状菌属(methanoculleus),甲烷鬃菌属(methanosaeta),甲烷螺菌属(methanospirillum)和马氏甲烷八叠球菌(methanosarcina mazei)等类群。经PCR-DGGE分析,沼气池中细菌因运行阶段和运行状况的不同而有所不同,启动期主要是γ-变形菌纲(gamma proteobacterium)和杆菌(bacillus),正常产气阶段和运行末期主要是真杆菌属(eubacterium)细菌,另一地点沼气池中拟杆菌纲(bacteroidetes)细菌为另一优势微生物群;沼气池运行的不同阶段,古菌均以氢营养型的甲烷粒菌属(methanocorpusculum)为主,另一地点正常池中以甲烷袋状菌属(methanoculleus)和甲烷鬃菌属(methanosaeta)为主。较之产甲烷古菌,细菌多样性丰富得多。 【关键词】：沼气池 微生物群落 MPN T-A克隆 DGGE
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S216.4
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 科学依据11-13
• 1.1.1 沼气发酵的基本原理11-12
• 1.1.2 沼气发酵的主要微生物及其相互作用12-13
• 1.2 国内外研究进展13-15
• 1.3 研究目的和意义15
• 1.4 研究内容与主要技术路线15-18
• 1.4.1 主要技术路线15-16
• 1.4.2 主要技术方法16-17
• 1.4.3 主要研究内容17-18
• 第二章 沼气池中主要微生物的 MPN 计数分析18-26
• 2.1 实验材料18-19
• 2.2 培养基19-20
• 2.3 实验方法20-21
• 2.4 结果与讨论21-25
• 2.4.1 观测结果21-23
• 2.4.2 计数23-24
• 2.4.3 讨论24-25
• 2.5 本章小结25-26
• 第三章 沼气池中细菌和古菌16S RDNA 克隆文库的构建26-43
• 3.1 实验材料26
• 3.2 实验方法26-33
• 3.2.1 样品基因组 DNA 的提取26-28
• 3.2.2 16S rDNA 扩增、纯化和定量28-29
• 3.2.3 16S rDNA 克隆文库的构建29-33
• 3.2.4 16S rDNA 序列测定33
• 3.3 结果与讨论33-42
• 3.3.1 DNA 提取33-35
• 3.3.2 PCR 扩增35-37
• 3.3.3 克隆文库的构建37-38
• 3.3.4 沼气池中微生物的多样性38-42
• 3.4 本章小结42-43
• 第四章 沼气池中细菌和古菌的 DGGE 分析43-54
• 4.1 实验材料43
• 4.2 主要试剂及其配制43-44
• 4.3 实验方法44-47
• 4.3.1 样品基因组 DNA 的提取44
• 4.3.2 细菌高变区片段的扩增44
• 4.3.3 古菌16S rDNA 序列扩增44-45
• 4.3.4 古菌高变区片段的扩增45
• 4.3.5 DGGE 分析45-47
• 4.3.6 切胶回收47
• 4.3.7 扩增和测序47
• 4.4 结果与讨论47-53
• 4.4.1 基因组 DNA 提取47-48
• 4.4.2 PCR 扩增48-50
• 4.4.3 Reconditioning PCR50-51
• 4.4.4 沼气池中细菌的多样性51-52
• 4.4.5 沼气池中古菌的多样性52-53
• 4.5 本章小结53-54
• 第五章 全文结论及工作展望54-56
• 5.1 结论54
• 5.2 存在问题54-55
• 5.3 工作展望55-56
• 参考文献56-62
• 附录62-70
• 致谢70-72
• 作者简历72

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