三峡库区消落带土壤和人工污水处理系统中与氮转化相关的微生物研究

【摘要】：亚硝酸盐驱动型甲烷厌氧氧化是最近发现的一个耦合地球碳循环和氮循环的重要反应,该反应主要是由一类归属于NC10门的细菌M.oxyfera-like细菌来完成。该类菌能将甲烷在厌氧和亚硝酸盐存在的条件下转化为二氧化碳、水和氮气,因而能缓解甲烷造成的温室效应,但是,它们在自然界的分布和存在状态还远没有得到充分描述。除了亚硝酸盐驱动型甲烷厌氧氧化外,在厌氧环境中,氨和硝酸盐也可以通过厌氧氨氧化菌介导的厌氧氨氧化途径转化为氮气,该反应被认为是最经济有效的废水脱氮过程,并且被认为是自然界厌氧条件下氮转化的重要途径。虽然厌氧氨氧化菌在很多自然环境中的生态分布和作用得到了详细研究,但是,对于它与Methylomirabilis oxyfera-like菌在自然环境中的共存状况报道的还很少。三峡大坝建成后所形成的三峡库区消落带是一个半年淹没半年暴露的特殊水生生境,其中的甲烷排放一直是研究者关注的焦点。在本论文中,我们首先系统研究了三峡库区消落带土壤中反硝化甲烷厌氧氧化菌M.oxyfera及厌氧氨氧化菌的生态分布、多样性、及其与环境理化性质之间的相关性;其次,我们在实验室构建了序批式生物反应器(SBR)硝化反应器和以厌氧氨氧化为主的全自养脱氮反应器(CANON反应器),通过添加一定浓度的联氨(H2N4),探索其对脱氮过程中相关功能微生物的影响,并利用Q-PCR技术探究其丰度的变化。主要取得如下结果:(1)在三峡水库水位明显下降的3月份,沿着三峡库区消落带,在香溪河河(XXH)、长江巫山干流(WS)、涪陵王家沟(WJG)、小江(XJ)、苎溪河(ZXH)及涪陵附近的一稻田土进行取样,分析了土壤中的pH、总有机碳、干物质含量、氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐和铁含量。结果表明,氨氮和亚硝酸盐的含量低于检出限。通过文献调研,在该香溪河、巫山、小江消落带取样点甲烷的年均排放通量为0.34mg/m2h,水稻田的排放量为4.86mg/m2h,其他取样点的甲烷排放量未见报道。(2)对上述土壤样品进行总DNA提取,利用专一于M.oxyfera-like细菌和Anammox细菌的16S rRNA基因的引物进行定量PCR测定,分析M.oxyfera-like和Anammox两类细菌在上述土壤样品中的存在和丰度。结果表明:在所有的样品中均有M.oxyfera-like细菌和Anammox细菌存在。消落带土壤中M.oxyfera-like的丰度为1.15±0.2×105-1.48±0.16×107 copies/g干重,这显著高于该区域水稻田土壤(p0.01);在消ii落带土壤中anammox的丰度明显低于m.oxyfera-like细菌,丰度为1.07±0.42×103-7.77±0.87×104copies/g干重;而在水稻田中该菌的丰度则明显高于m.oxyfera-like细菌,并且也明显高于所有消落带土壤中的anammox菌丰度(p0.01),达到9.78±0.78×103-3.65±0.76×106copies/g干重。皮尔逊相关性分析表明m.oxyfera-like细菌的丰度和no3--n的含量显著正相关。anammox丰度和环境因子之间的相关性也不显著。(3)在以上结果的基础上,我们分别构建了m.oxyfera-like细菌在样品ws、wjg和zxh(分别代表了两种菌的最高、中间和最低的丰富度)中的16srrna基因、甲烷氧化过程的关键酶—甲烷单加氧酶α亚基(pmoa)基因和厌氧氨氧化的关键酶—联氨合酶β亚基(has_b)基因文库。通过测序和进化树构建,我们对这两类菌在三峡库区消落带土壤中的多样性进行了系统研究。结果表明:m.oxyfera-like细菌的134条16srrna序列中,128条与m.oxyfera表现出了84.38-98.92%的相似性,这些序列分布在进化树的4个group中;141条pmoa基因序列中134条和m.oxyfera表现出了84.62-95.38%的一致性,在进化树中分布于6个cluster中。在获得的103条anammox的hzs_b序列中,分别有57.28%和24.27%与anammox的candidatus‘brocadiafulgida,candidatus‘brocadiaanammoxdianas聚在一起,相似性达到88.02-88.28%和84.11%-85.68%;13.59%的序列和candidatus‘kuenenia’聚在一起,相似性达到89.58%-98.44%;4.85%序列独立形成一支。(4)sbr硝化反应器以污水处理厂好氧池和厌氧池混合污泥作为种泥,开始进水nh4+-n浓度为51mg/l左右,逐渐增加至505mg/l左右,氮负荷率从起始阶段的102.9mg/l*d逐渐增加到1056.2mg/l*d。此时添加2mg/l的n2h4,反应器的运行效率出现了急剧的下降,氨氧化率从100%下降到最后的2.45%。氨氧化分为两个过程:即nh4+-n氧化为no2--n过程,关键微生物为氨氧化细菌(aob);no2--n氧化为no3--n的过程,关键微生物为亚硝酸盐氧化还原菌(nob)。分别采用这两类微生物的关键酶氨单加氧酶的α亚基(amoa)基因和亚硝酸盐氧化还原酶β亚基(nxrb)基因的特异性引物对种泥,富集培养后和添加n2h4后三个时期的活性污泥中两种微生物进行定量分析。结果表明,amoa基因拷贝数从2.01×106copies/g干污泥增加到1.0×109copies/g干污泥,nxrb基因的拷贝数为从4.20×105copies/g增加到1.28×107copies/g。添加n2h4后,这两种功能微生物的丰度分别下降为2.09×104copies/g和2.56×105copies/g。采用同样的引物构建克隆文库测序分析表明:获得的19条amoa基因序列中52.63%的序列属于Nitrosococcu;31.58%的的序列属于Nitrosomonas;15.79%序列属于亚硝化螺菌属Nitrosospira。获得的20条nxrB基因序列中,55%属于Nitrobacter winogradskyi;20%属于Nitrobacter vulgaris;15%属于Nitrobacter hamburgensis.(5)实验室稳定运行的CANON反应器,进水NH4+-N浓度维持在200mg/L左右时,NH4+-N和TN的去除率可以达到68%和65%,NLR为269mg/L*d左右。添加N2H4强化后,在进水NH4+-N浓度高达310mg/L时,NH4+-N和TN的去除率分别稳定在82.13%和72.65%左右,反应器的NLR率高达456.80mg/L*d。除AOB和NOB外,对该反应器中另一类关键微生物anammox进行了定量和多样性分析,采用的引物为该菌特异性的联氨合酶α亚基(hzs_A)基因。定量PCR分析表明:未添加N2H4前amoA的基因和nxrB基因拷贝数分别为1.03×107copies/g干污泥和1.30×106copies/g干污泥,而在添加N2H4后其拷贝数为6.26×104copies/g干污泥和1.66×105copies/g干污泥。Anammox的hzsA基因的拷贝数从3.14×109copies/g增加到5.84×1010opies/g。克隆文库测序分析表明:在获得的15条amoA基因中,66.67%的序列分布在Nitrosomonas属;33.33%的序列分布在Nitrosococcus属。获得的15条nxrB基因序列中,26.67%属于Nitrobacter vulgaris;53.33%属于Nitrobacter winogradskyi;20%属于Nitrobacter hamburgensis。anammox的hzsA基因的13条序列中38.46%属于待定的阶梯烷菌属(Candidatus Scalindua);15.38%属于待定的厌氧氨氧化丙酸球菌属(Candidatus Anammoxoglobus propionicus);46.15%的序列未能确定具体的种属。 【关键词】：反硝化甲烷氧化菌 厌氧氨氧化菌 消落带 联氨 定量PCR
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X703;X172;X53
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 引言14-26
• 1.1 消落带的形成及甲烷排放14-16
• 1.1.1 消落带的形成14
• 1.1.2 消落带的污染14-15
• 1.1.3 消落带土壤甲烷的排放15-16
• 1.2 甲烷的厌氧氧化16-18
• 1.2.1 甲烷的厌氧氧化类型16-17
• 1.2.2 甲烷的厌氧氧化过程中的功能微生物17-18
• 1.3 铵盐的厌氧氧化18-20
• 1.4 生物脱氮的原理及在污水处理中的应用20-23
• 1.4.1 水污染现状20
• 1.4.2 废水生物脱氮的原理和工艺进展20-21
• 1.4.3 生物脱氮过程中功能微生物研究21-23
• 1.5 分子生物学技术在功能微生物研究中的应用23-24
• 1.6 本研究的目的意义24-26
• 第二章 三峡库区消落带土壤中M. oxyfera-like和Anammox的生态分布研究26-54
• 2.1 前言26
• 2.2 材料与方法26-35
• 2.2.1 样品的采集26-28
• 2.2.2 样品物理化学性质28
• 2.2.3 仪器和试剂28-29
• 2.2.4 土壤微生物基因组DNA的提取29-30
• 2.2.5 荧光定量PCR基因的选择30-31
• 2.2.6 目的基因的荧光定量分析31-33
• 2.2.7 多样性分析功能基因选择33-35
• 2.2.8 克隆测序35
• 2.2.9 统计分析35
• 2.3 结果分析35-51
• 2.3.1 三峡库区消落带描述35-36
• 2.3.2 消落带土壤理化性质的测定36-38
• 2.3.3 功能微生物丰度研究38-42
• 2.3.4 M. oxyfera-like细菌的 16S rRNA基因多样性研究42-46
• 2.3.5 M. oxyfera-like细菌的pmoA基因多样性研究46-49
• 2.3.6 Anammox细菌的hzsB基因多样性分析49-50
• 2.3.7 M. oxyfera-like细菌、Anammox的空间分布和环境因子之间的相关性研究50-51
• 2.4 小结51-54
• 第三章 序批式硝化反应器的构建、运行以及联氨对硝化过程的调控作用54-66
• 3.1 前言54-55
• 3.2 材料和方法55-58
• 3.2.1 反应器构建及运行55-56
• 3.2.2 样品来源56
• 3.2.3 活性污泥DNA的提取56
• 3.2.4 功能基因的选择56-57
• 3.2.5 功能微生物荧光定量分析57-58
• 3.2.6 微生物功能基因多样性分析58
• 3.3 结果和讨论58-65
• 3.3.1 SBR硝化反应器的运行及联氨对其调控58-60
• 3.3.2 联氨对硝化过程中和氮转化有关的主要功能微生物的调控作用60-62
• 3.3.3 SBR硝化反应器中氨单加氧酶基因（amoA）多样性研究62-64
• 3.3.4 SBR硝化反应器中亚硝酸盐氧化还原酶基因（nxrB）的多样性研究64-65
• 3.4 小结65-66
• 第四章 全自养脱氮反应器的构建、运行和联氨的调控作用66-82
• 4.1 前言66-67
• 4.2 材料和方法67-69
• 4.2.1 反应器的运行67
• 4.2.2 样品来源67
• 4.2.3 活性污泥基因组DNA的提取67
• 4.2.4 功能基因的选择67-69
• 4.2.5 功能微生物荧光定量研究69
• 4.2.6 微生物功能基因多样性研究69
• 4.2.7 基于Illumina高通量测序的微生物群落进化研究69
• 4.3 结果和讨论69-79
• 4.3.1 CANON反应器的运行效果69-71
• 4.3.2 联氨对CANON反应器的运行和主要功能微生物的调控作用71-73
• 4.3.3 CANON反应器中氨单加氧酶（amoA）基因多样性研究73-74
• 4.3.4 CANON反应器中亚硝酸盐氧化还原酶（nxrB）基因多样性研究74-75
• 4.3.5 CANON反应器中联氨合酶（hzsA）基因多样性研究75-76
• 4.3.6 CANON反应器中微生物群落结构进化研究76-79
• 4.4 小结79-82
• 第五章 结论与展望82-86
• 5.1 结论82-84
• 5.2 研究展望84-86
• 参考文献86-96
• 致谢96-98
• 攻读学位期间发表的学术论文目录98-99

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