典型抗生素和抗药性基因在污水处理系统中的归趋及迁移分布规律

【摘要】：抗生素是一类用来预防和治疗细菌感染疾病最为重要的药物。由于人类对其过分地使用甚至是滥用,导致这类化合物及其代谢产物被持续不断地排入地表水、地下水和土壤等环境介质中。虽然这些化合物的暴露浓度通常相对较低,但由于其本身具有较强的持久性、生物反应活性及难生物降解性等特点,因此可以对人类和水生、陆生生物产生长期性的潜在危害影响。更为严重的问题是,这些低浓度抗生素药物对细菌微生物能够产生持久性的选择性压力,使其逐渐具有抗药性特征,这类抗药性菌群的快速演变和散播,将会对人类和其它生物的健康和安全造成难以预计的威胁。近年来,随着环境分析手段的快速发展和应用,这类以往常常被忽略的新型微污染物已逐渐引起了环境工作者和公众的广泛关注。 已有的研究表明,城市污水是抗生素药物和抗药性细菌进入环境的主要途径。由于绝大多数城市污水处理工艺只能部分去除污水中的持久性抗生素药物,在某些情况下甚至无任何去除效果,许多研究都相继报道了在城市污水处理厂处理出水和污泥中检测出不同浓度范围的抗生素药物和抗药性细菌,因此非常有必要针对这些微污染物在污水处理系统中的归趋和迁移分布规律进行系统地考察和研究。 本课题首先建立了一种能够同时检测污水和污泥中15种不同微量药物的加速溶剂萃取-固相萃取-液相串联双质谱(ASE-SPE-LC-MS/MS)检测分析方法,然后以美国密歇根州East Lansing的一家采用传统活性污泥法处理工艺的污水处理厂作为研究对象,检测分析这些药物在不同处理工艺段污水和污泥中的浓度分布,同时通过质量平衡计算,研究掌握这些微污染物在城市污水处理厂内的迁移分布规律和去除机制。与此同时,采用细菌活菌平板计数法和荧光定量PCR分析手段,针对不同处理工艺段污水和污泥中的抗药性细菌和抗药性基因的浓度水平进行检测分析,研究污水和污泥中磺胺类和四环素类抗生素药物对其相应抗药性细菌和抗药性基因的选择性压力,探讨它们之间的相关关系。研究结果如下： (1)污泥中微量药物的ASE-SPE-LC-MS/MS分析方法的建立 本研究建立的分析方法对污泥中15种不同药物的萃取效果较好,检测灵敏度较高,并且检测重复性好,检测限范围在0.6μg/kg(磺胺二甲基嘧啶)到146μg/kg(四环素)之间。此外,污泥中其它杂质组分的基体效应对药物的有效萃取和检测分析影响较小。 在加速溶剂萃取操作优化过程中,体积比为7：3的乙腈／水混合溶剂对污泥中15种不同药物的萃取效果最好,回收率可达52.0-96.4%,而降低萃取溶剂的pH值对改善药物的萃取效率作用不大。萃取压力、萃取温度和萃取时间对药物的萃取均有不同程度的影响,当操作压力为10.0 MPa,萃取温度为100℃,连续萃取3次,每次萃取时间为15 min时,加速溶剂萃取对分析药物的萃取效果最好。 (2)典型药物在活性污泥法处理工艺中的分布规律和去除机制 根据检测结果可知,除去甲基金霉素、磺胺甲基嘧啶、红霉素和泰乐菌素这4种药物在所有污水和污泥样中未被检出外,其它药物均至少被检出1次,其中,金霉素在原水进水和初沉池污泥中的平均浓度分别为178 ng/L和61μg/kg,在最终处理出水和脱水污泥中未被检出。与此同时,其它10种药物在原水进水中的浓度差别很大,变化范围为26 ng/L(磺胺二甲基嘧啶)到61683 ng/L(对乙酰氨基酚),经过生物处理后,这些药物在最终处理出水中的平均浓度变化范围为未检出(磺胺二甲基嘧啶)到370 ng/L(强力霉素)之间,而在脱水污泥中的残留浓度范围则在3.5μg/kg(磺胺二甲基嘧啶)到568μg/kg(强力霉素)之间。通过质量平衡计算分析可得,微生物降解作用是这些药物在污水处理过程中得以去除的主要机制,而污泥吸附作用对这些药物去除的影响很小,低于7.1%。尽管如此,强力霉素、土霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑和林可霉素在污水生物处理过程中只能被部分去除,在最终处理出水中的残留比例仍分别高达50%,61%,73%,11%和60%。 值得特别注意的是,卡马西平在经过污水生物处理后出现了负增长,即其在最终处理出水中的浓度要高于原水进水中的浓度,这有可能是因为原水进水中本来就存在的卡马西平代谢产物在生物处理过程中又重新转化为母体,从而导致卡马西平浓度的升高。 (3)四环素类和磺胺类抗药性基因和细菌在污水处理工艺中的分布去除规律 根据检测结果分析可知,活性污泥法污水处理工艺可以有效地降低污水中的四环素和磺胺甲恶唑抗性细菌浓度,以及tetO、tetW和sulI抗药性基因浓度。四环素和磺胺甲恶唑抗性细菌在最终处理出水中的浓度分别为1.0Sx101CFU/mL和3.09x103CFU/mL,而在脱水污泥中的浓度分别高达7.08x106CFU/g和3.09x108CFU/g。与此同时,tetO.tetW和sull抗药性基因在最终处理出水中的浓度分别为1.05×106copies/100mL、9.12x105 copies/100mL和5.13x105 copies/100mL,而在脱水污泥中的浓度分别高达1.78x109 copies/g、5.62x108 copies/g和1.00x108 copies/g。 抗药性基因的降低去除主要集中在生物处理单元,而氯消毒工艺对其去除的影响不大,这可能是因为氯消毒剂主要是通过抑制细菌体酶的活性以达到灭活细菌的目的,其并不能对细菌的DNA结构产生破坏作用,另外,由于携带tetO、tetW和sull抗药性基因的细菌以革兰氏阳性菌为主,而一些革兰氏阳性菌可以通过自身合成特定的蛋白质或是相互团聚来抵抗氯消毒剂的灭活作用,从而导致氯消毒工艺对污水中抗药性基因降低去除效果较差。 通过对污水和污泥中抗生素药物浓度与相应抗药性细菌和抗药性基因浓度进行线性拟合分析可知,污水中tetO和tetW抗药性基因浓度与四环素类抗生素浓度之间的线性相关关系不显著,这主要是因为我们只定量检测了tetO和tetW两种四环素类抗药性基因,然而在污水中还存在着很多其它类型的tet基因。相比之下,sull抗药性基因浓度和磺胺类抗生素浓度之间则呈现出较好的线性关系,表明磺胺类抗生素对污水中sull抗药性基因的产生和演变具有一定的促进作用。原水进水和最终处理出水中的四环素和磺胺甲恶唑抗性细菌与对应四环素类和磺胺类抗生素浓度之间也呈现出较好的线性相关关系。尽管如此,在污泥中未发现抗药性基因和抗药性细菌浓度与抗生素药物浓度之间具有显著的相关关系。 【关键词】：抗生素 抗药性基因 抗药性细菌 污水处理 质量平衡 加速溶剂萃取 固相萃取
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：X703
【目录】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-16
• 第1章 绪论16-58
• 1.1. 抗生素药物的使用情况16-17
• 1.2. 环境中抗生素药物的来源17-18
• 1.3. 抗生素药物在环境中的分布和迁移转化18-42
• 1.3.1. 地表水、地下水和饮用水中抗生素药物的浓度水平18-25
• 1.3.2. 土壤和河流沉积物中抗生素药物的浓度水平25-28
• 1.3.3. 抗生素药物在污水处理工艺中的行为特征28-42
• 1.4. 环境中抗生素药物的检测分析方法42-50
• 1.4.1. 预处理方法42-50
• 1.4.2. 定量分析方法50
• 1.5. 细菌抗药性的产生以及在环境中的散播50-54
• 1.5.1. 细菌抗药性的主要机制51-53
• 1.5.2. 细菌抗药性的获得途径53
• 1.5.3. 抗药性细菌在环境中的散播53-54
• 1.6. 本课题的研究内容和技术路线54-58
• 1.6.1. 研究内容54-55
• 1.6.2. 技术路线55-58
• 第2章 污泥中微量药物的ASE-SPE-LC-MS/MS分析方法的建立58-78
• 2.1. 引言58
• 2.2. 材料和方法58-67
• 2.2.1. 实验药品59
• 2.2.2. 污泥样品的采集和预处理59-64
• 2.2.3. 污泥中药物的萃取和富集64-65
• 2.2.4. 液相串联双质谱装置65-67
• 2.2.5. 分析方法的验证67
• 2.3. 结果与讨论67-76
• 2.3.1. ASE萃取溶剂的选择67-70
• 2.3.2. ASE操作条件参数的优化70-72
• 2.3.3. 方法验证72-73
• 2.3.4. 固相萃取和富集73-75
• 2.3.5. 实际污泥样品的测定75-76
• 2.4. 本章小结76-78
• 第3章 典型药物在活性污泥法处理工艺中的分布规律和去除机制78-94
• 3.1. 引言78-79
• 3.2. 材料和方法79-83
• 3.2.1. East Lansing污水处理工艺概况79-80
• 3.2.2. 样品采集和预处理80
• 3.2.3. 样品萃取和富集80-82
• 3.2.4. LC-MS/MS测定分析82
• 3.2.5. 质量平衡计算分析82-83
• 3.3. 结果与讨论83-92
• 3.3.1. 污水处理工艺83
• 3.3.2. 污水中药物的浓度分布83-87
• 3.3.3. 污泥中药物的浓度分布87-89
• 3.3.4. 质量平衡分析89-92
• 3.4. 本章小结92-94
• 第4章 四环素类和磺胺类抗药性基因和细菌在污水处理工艺中的分布去除规律94-116
• 4.1. 引言94-95
• 4.2. 材料和方法95-99
• 4.2.1. 样品采集和预处理95-96
• 4.2.2. 抗药性细菌的确定96-97
• 4.2.3. DNA的提取97-98
• 4.2.4. 抗药性基因的荧光定量PCR测定98-99
• 4.2.5. 四环素类和磺胺类抗生素浓度的测定99
• 4.2.6. 数据统计分析99
• 4.3. 结果与讨论99-114
• 4.3.1. 四环素类和磺胺类抗生素在污水处理工艺中的浓度水平99-101
• 4.3.2. TC和SMX抗性细菌在污水处理工艺中的浓度分布101-104
• 4.3.3. 抗药性基因tetO、tetW和sull在污水处理工艺中的浓度分布104-110
• 4.3.4. 抗生素浓度与相应抗药性基因和细菌之间的相关关系110-114
• 4.4. 本章小结114-116
• 第5章 结论与展望116-120
• 5.1. 结论116-117
• 5.1.1 全文总结116-117
• 5.1.2 论文创新点117
• 5.2. 展望117-120
• 参考文献120-134
• 攻读学位期间发表的学术论文134-136
• 致谢136

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