十溴联苯乙烷肝毒性及肝代谢机制初步研究

【摘要】：【目的】十溴联苯乙烷（Decabromodiphenyl ethane,DBDPE）作为多溴联苯醚类（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）阻燃剂的替代品于上世纪90年代进入市场，由于其高分子量和低脂溶性，在很长一段时间内被认为难以释放到环境中、难以被生物降解和利用。2003年，DBDPE首次在淤泥中被检出，随后被从室内空气、污水等介质和生物体内检出，表明DBDPE与其结构类似物十溴联苯醚（Decabromodiphenyl ether，BDE-209）一样，可以进入环境，并可在环境、食物链以及生物体内发生蓄积。相关研究显示，DBDPE人群环境暴露水平持续增加，人体蓄积水平呈现较快增加趋势。因此有必要开展DBDPE对生物体的潜在健康危害研究。目前针对DBDPE的毒理学评价研究开展的比较少。Hardy等开展的啮齿类动物和水生生物毒性研究表明，DBDPE难以被生物体降解，健康危害风险水平低。Nakari等采用水生生物开展的毒性研究表明，DBDPE可被水生生物降解，并对水生生物具有急性毒性、雌激素样作用及生殖毒性，但其实验设计存在一定的缺陷，研究中采用甲苯作为溶剂。此外，目前对DBDPE的代谢和毒作用机制也尚不清楚，而DBDPE的结构类似物PBDEs可作用于机体内分泌系统相关受体，干扰机体内分泌系统和代谢平衡。基于已开展研究之间的结果差异和DBDPE结构类似物的毒理学特征、毒作用机制，结合肝代谢在溴化阻燃剂（bromoniated flame retardants，BFRs）毒性作用中的关键作用，本研究开展了DBDPE的肝毒性和肝代谢机制研究，以期解决目前研究中存在的问题，获得准确的实验数据，为开展进一步研究提供可靠的研究基础和指明方向。 【内容和方法】参考DBDPE结构类似物BDE-209的实验设计，本研究首先选用人肝癌细胞株HepG2细胞作为实验对象；采用0-100mg/L DBDPE作为HepG2细胞染毒剂量，选择二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作为DBDPE溶剂配制系列染毒液，DMSO在染毒液中浓度保持0.5%(V/V)；染毒时间为24h、48h和72h。染毒结束后，采用噻唑蓝（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）实验和L-乳酸脱氢酶（L-Lactic dehydrogenase，LDH）实验分别对细胞存活率和细胞损伤情况进行测定；采用Hoechst33258染料对染毒后细胞染色，倒置荧光显微镜下观察、记录细胞变化和损伤程度；采用碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色-流式细胞仪检测方法测定细胞凋亡情况；为探究细胞损伤和细胞凋亡机制，本研究测定了染毒后活性氧自由基（reactiveoxygen species，ROS）含量；为验证ROS与细胞损伤和细胞凋亡的关系，染毒前在细胞培养基中加入ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC），染毒结束后，采用MTT实验和PI染色-流式细胞仪检测方法分别测定细胞存活率和凋亡情况，分析NAC加入前后ROS生成、细胞存活率和凋亡变化情况，以验证ROS与细胞损伤的关系。 本研究选择Wistar大鼠作为染毒对象，选择购自美国雅宝公司的商品化DBDPE产品（DBDPE纯度≥98.5%）作为染毒化合物，参照已开展研究实验设计，设置染毒剂量为0-1000mg/kg/d，选择经口染毒方式；染毒28天后，测定Wistar大鼠体重、肝脏重量、脏器系数和肝脏功能性损伤生化指标，探讨DBDPE对肝脏的损伤情况；考虑到细胞毒性研究中DBDPE可以诱导HepG2细胞ROS含量增加，对相关的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、总超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）等氧化损伤指标进行了测定，以期在动物水平验证氧化损伤与肝脏毒性的关系。此外，本研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real time-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技术对不同染毒剂量组的大鼠肝脏多种相关的细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）在mRNA水平进行了测定；进而采用Western blot实验对mRNA水平发生显著改变的CYP450酶在蛋白水平进行了测定；采用超高速离心技术获得大鼠肝脏微粒体，对CYP2B酶对应的PROD（pentoxyresorufin O-dealkylation）、CYP3A酶对应的LBD （Luciferin benzylether debenzylase）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（Uridinediphosphate-glucuronosyltransferase，UDPGT）活性进行了测定，以分析和推断DBDPE在肝脏中的代谢情况和作用机制。 【结果】在HepG2细胞毒性研究实验部分，利用0-100.0mg/L DBDPE对HepG2细胞染毒24h、48h和72h，MTT实验、LDH实验和细胞形态学观察实验表明，DMSO对细胞存活率、细胞损伤程度以及Hoechst33258染色细胞形态学改变的影响与对照组之间无显著性差异；0-6.25mg/L剂量染毒24h、48h和72h后细胞存活率、细胞损伤程度以及细胞形态学改变与对照组相比无显著性差异；12.5-100.0mg/L剂量染毒48h和72h可降低细胞存活率、增加细胞损伤程度和引起细胞形态学显著改变，具有明显的时间和剂量-反应关系；PI染色-流式细胞仪检测发现，12.5-100mg/L剂量DBDPE可诱导HepG2细胞凋亡，存在时间和剂量-反应关系；研究还发现，DBDPE可诱导HepG2细胞ROS生成量增加，通过NAC验证试验，证实DBDPE诱导的细胞凋亡和损伤与ROS有关。 在DBDPE对Wistar大鼠染毒动物毒性研究中，采用0-1000mg/kg剂量DBDPE对Wistar大鼠连续经口染毒28天后发现，DBDPE染毒后Wistar大鼠体重、肝脏重量、脏器系数等指标与对照组相比，无显著性差异；血清学检测发现，较高剂量组DBDPE可诱导雄性Wistar大鼠乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙转氨酶（Glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartatetransaminase，AST）、胆汁酸（Total bile acid，TBA）、总胆红素（total bilirubin，TBA）和葡萄糖（Glucose，Glu）的显著改变，部分剂量组还可诱导γ-谷氨酰转移酶（glutamyl transpeptidase，GGT）、血浆总蛋白（Total protein，TP）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、尿素氮（urea nitrogen，UN）和肌酐（Creatinine，Cr）的显著改变；此外，较高剂量组DBDPE还可诱导雌性Wistar大鼠碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、AST和Glu的显著改变，部分剂量组还可诱导TBA、Cr和TG的显著改变。此外，中高DBDPE染毒剂量组GSH水平与对照组存在显著性差异，结合DBDPE可致HepG2细胞ROS生成量增加，提示DBDPE可能致肝脏发生氧化损伤。上述结果表明， DBDPE对大鼠具有肝毒性，可引起肝损伤，还可影响大鼠胆汁排泄等功能和正常糖等的代谢，且相关研究结果提示DBDPE可能干扰肝脏脂肪和蛋白的代谢，分析DBDPE可能具有一定的内分泌干扰作用，可能通过干扰机体内分泌途径，启动机体某些信号通路，干扰机体正常代谢功能；还可能通过氧化损伤等作用引起肝损伤，进而引起代谢功能受损。 DBDPE对Wistar大鼠染毒后，肝CYP450代谢酶mRNA、蛋白和酶活性检测发现，染毒组CYP1A1/2mRNA与对照组相比无显著性差异，提示DBDPE可能具有较低或无二噁英样毒性作用；CYP2B1和CYP3A1/3mRNA与对照组相比无显著性差异；雄性大鼠CYP2B2、CYP3A2在三个水平上，较高剂量组与对照组相比存在显著差异；雌性大鼠CYP2B2、CYP3A2在三个水平上，个别剂量组与对照组相比存在显著差异；UDPGT活性检测表明，较高剂量组DBDPE对雄性大鼠UDPGT活性具有诱导作用，并具有一定的剂量反应关系；仅500mg/kg.d剂量组DBDPE对雌性大鼠UDPGT活性的影响与对照组存在显著性差异。据此推测DBDPE对Wistar大鼠代谢酶的影响存在一定的性别差异，对雄性Wistar大鼠影响较大；分析认为DBDPE可能通过激活组成型雄烷受体（constitutiveandrostane receptor，CAR）和孕烷X受体（pregnane xenobiotic receptor，PXR）信号通路，进而诱导肝脏Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶对DBDPE进行代谢以及干扰Wistar大鼠内分泌系统，影响Wistar大鼠体内正常代谢稳态，发挥毒性作用。 【结论】DBDPE具有一定的肝毒性，ROS和氧化损伤分别在肝细胞毒性和大鼠肝损伤中发挥重要作用；DBDPE可能具有较低或无二噁英样毒性作用；DBDPE可通过CAR和PXR信号通路诱导大鼠肝代谢酶活性；DBDPE还可能通过CAR/PXR信号通路干扰内源性活性物质的动态平衡，具有一定的内分泌干扰活性；DBDPE对大鼠的毒性作用具有一定的性别差异，雄性大鼠较雌性大鼠敏感。 【关键词】：十溴联苯乙烷 肝毒性 内分泌干扰活性 肝代谢酶 活性氧自由基
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114
【目录】：

• 缩略词7-9
• 摘要9-13
• Abstract13-17
• 前言17-25
• 第一章 DBDPE 染毒 HepG2 细胞毒性研究25-42
• 1. 材料25-28
• 1.1. 主要试剂和耗材25-26
• 1.2. 仪器26-27
• 1.3. 主要溶液配制27-28
• 2. 方法28-31
• 2.1. 细胞复苏28
• 2.2. 细胞传代28-29
• 2.3. 细胞冻存29
• 2.4. 细胞计数29
• 2.5. MTT 实验29-30
• 2.6. LDH 实验（参照实际和说明书）30
• 2.7. Hoechst33258 染色实验30
• 2.8. PI 染色-流式细胞仪测定细胞凋亡实验30-31
• 2.9. ROS 测定实验（参照试剂盒说明书）31
• 3. 结果31-39
• 3.1. MTT 实验结果31-32
• 3.2. LDH 实验结果32-33
• 3.3. Hoechst 33258 染色实验结果33
• 3.4. PI 染色-流式细胞仪测定实验结果33-35
• 3.5. ROS 测定实验结果35-37
• 3.6. 添加 NAC 后 ROS、细胞存活率和细胞凋亡测定实验结果37-39
• 4. 讨论39-42
• 第二章 DBDPE 染毒 Wistar 大鼠肝毒性研究42-57
• 1. 材料43-44
• 1.1. 主要试剂和耗材43
• 1.2. 仪器43-44
• 1.3. 主要溶液配制44
• 2. 方法44-47
• 2.1. 动物染毒44
• 2.2. 动物处理44-45
• 2.3. 血生化指标检测45
• 2.4. 谷胱甘肽（GSH）测定45
• 2.5. 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定45-46
• 2.6. 丙二醛（MDA）测定46
• 2.7. 总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定46-47
• 3. 结果47-54
• 4. 讨论54-57
• 第三章 DBDPE 染毒 Wistar 大鼠肝代谢机制研究57-78
• 1. 材料57-60
• 1.1. 主要试剂和耗材57-58
• 1.2. 仪器58-59
• 1.3. 主要溶液配制59-60
• 2. 方法60-68
• 2.1. 总 RNA 的提取60-61
• 2.2. RNA 浓度的测定和质量分析61
• 2.3. RNA 反转录61-62
• 2.4. 实时荧光定量 PCR 测定62
• 2.5. 蛋白浓度测定62-63
• 2.6. 肝组织蛋白样品的制备63
• 2.7. Western Blot 实验测定63-64
• 2.8. 微粒体制备64-65
• 2.9. UDPGT 活性测定65
• 2.10. CYP2B2 酶活性测定（参照试剂盒说明书）65-67
• 2.11. CYP3A2 酶活性测定（参照试剂盒说明书）67-68
• 3. 结果68-75
• 3.1. mRNA 定量 PCR 测定结果68-69
• 3.2. Western Blot 测定结果69-72
• 3.3. UDPGT 活性测定结果72-73
• 3.4. PROD 活性测定结果73-74
• 3.5. LBD 活性测定结果74-75
• 4. 讨论75-78
• 结论78-80
• 参考文献80-92
• 附录论文一92-109
• 附录论文二109-133
• 个人简历133-134
• 致谢134

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