利用玉米秸秆水解液发酵生产2，3-丁二醇

【摘要】： 2,3-丁二醇是重要的化工原料及液体燃料,利用生物质转化生产2,3-丁二醇是替代传统化工合成的一种可行途径。由于石油资源的日渐紧缺,利用廉价的木质纤维作为原料发酵生产2,3-丁二醇更具有竞争力和应用价值,本文以玉米秸秆作为初始原料,研究了预处理、纤维素酶解、单批发酵、分批补料发酵、同步糖化发酵等各环节的关键技术参数,研究结果对于促进非粮食原料的生物转化利用具有重要意义。 对玉米秸秆的预处理技术进行了研究,结果表明:稀酸处理可以脱除大部分的半纤维素,稀碱处理可以脱除大部分的木质素。纤维素酶水解实验结果表明:碱处理后玉米秸秆酶解液中的单糖含量较高,主要得益于木质素的高脱除,以及润张后的纤维素成分更容易被纤维素酶所降解,稀碱预处理是一种有效的预处理方案。 预处理过程引入了无机盐,当代表性无机盐Na_2SO_4浓度低于20g/L时,对后续发酵无明显影响。乙酸和乙醇是主要的发酵副产物,当浓度分别超过20 g/L和5 g/L时,会对菌株生长产生明显抑制作用。 发酵适宜的初始pH值为6.0～6.5,总糖浓度为80～100g/L产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca ZU-03利用秸秆纤维素水解液单批发酵实验表明,在总糖浓度80g/L,30℃的条件下发酵64 h,总糖利用率可达到99.36%,2,3-丁二醇的质量浓度为37.20g/L,产率为0.468g/g,达到理论产率的93.6%。在此过程中实现了来自半纤维素和纤维素的五碳糖和六碳糖的共利用。 单批发酵中出现的底物抑制瓶颈可以通过分批补料策略来克服。研究表明12h是比较合适的补料起始时间,比较合适的单次补料量是15g/L。补料成分的较佳碳氮比为16,连续发酵204 h产物浓度达到100.14g/L,最高产量达到108.13g/L,相对于单批发酵,产量提高了190.7%,通过分批补料操作获得了较高的产物浓度,对于降低下游的分离成本具有实际价值。 同步糖化发酵法(Simultaneous saccharification and fermentation,SSF)生产2,3-丁二醇整合了酶解和发酵两个重要环节,不但省去了酶解液处理步骤,而且提高了生产效率,降低了成本。Klebsiella oxytoca ZU-03利用纤维原料同步糖化发酵生产2,3-丁二醇的适宜的温度为31℃,初始pH值为6.0,纤维素酶的合适用量为25 FPIU/g底物,纤维二糖酶用量是20 CBIU/g底物,SSF进行36 h,发酵液中2,3-丁二醇的浓度为23.30 g/L,产率为0.23 g/g底物。 利用玉米秸秆水解液发酵生产2,3-丁二醇,实现了农业废弃物的再利用。和化学合成相比,生物转化过程相对比较温和,因此对设备的损耗和能源的需求较低。发酵得到了有用的化合物2,3-丁二醇。此过程的研究为促进可降解废弃物的生物转化和利用开拓了一个新的方向。 【关键词】：玉米秸秆 预处理 纤维素 半纤维素 酶水解 2 3-丁二醇 分批补料发酵 同步糖化发酵
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：TQ923
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-31
• 1.1 2,3-丁二醇概况12-17
• 1.1.1 微生物生产2,3-丁二醇的代谢途径13-14
• 1.1.2 2,3-丁二醇生产的菌种14-15
• 1.1.3 2,3-丁二醇生产底物的选择15-17
• 1.2 影响微生物发酵生产2,3-丁二醇的因素17-19
• 1.2.1 pH值的影响17-18
• 1.2.2 温度的影响18
• 1.2.3 溶氧对于发酵的影响18-19
• 1.2.4 添加因子对于发酵的影响19
• 1.3 纤维素原料的生物利用19-26
• 1.3.1 纤维素酶的生产19-20
• 1.3.2 木质纤维原料20-22
• 1.3.3 纤维原料的预处理22-24
• 1.3.4 纤维素的酶法糖化24-25
• 1.3.4.1 纤维素酶系24
• 1.3.4.2 纤维素酶水解纤维素的机理24
• 1.3.4.3 影响纤维素酶水解纤维素的因素24-25
• 1.3.4.4 纤维素酶解的方式25
• 1.3.5 2,3-丁二醇生产菌种和纤维原料分解菌种的共培养25-26
• 1.4 基因工程改造菌株在2,3-丁二醇生产过程中的应用26-27
• 1.5 2,3-丁二醇的分离研究27-28
• 1.6 国内2,3-丁二醇的生产研究情况28-29
• 1.7 生物法生产2,3-丁二醇的展望29-30
• 1.8 本论文的研究思路30-31
• 第二章 玉米秸秆的预处理和酶解31-43
• 2.1 材料与方法32-35
• 2.1.1 原料与试剂32-33
• 2.1.1.1 原料32
• 2.1.1.2 化学试剂和酶制剂32-33
• 2.1.2 实验方法33-35
• 2.1.2.1 预处理工艺33
• 2.1.2.2 酶解方法33
• 2.1.2.3 分析方法33-35
• 2.1.2.4 酶活力测定35
• 2.2 结果与讨论35-41
• 2.2.1 稀硫酸预处理35-37
• 2.2.1.1 稀硫酸预处理前后玉米秸秆的成分变化35-36
• 2.2.1.2 玉米秸秆经稀酸预处理后的酶水解36-37
• 2.2.2 氢氧化钠碱预处理37-38
• 2.2.2.1 氢氧化钠预处理前后玉米秸秆的成分分析37-38
• 2.2.2.2 玉米秸秆经NaOH预处理后酶水解38
• 2.2.3 酸处理和碱处理的比较38-41
• 2.2.3.1 预处理前后玉米秸秆的成分变化38-39
• 2.2.3.2 预处理对物料重量损失和主要成分脱除率的比较39
• 2.2.3.3 两种预处理对于玉米秸秆酶水解促进的比较39-41
• 2.2.4 碱处理残渣的酶解进程41
• 2.3 小结41-43
• 第三章 利用玉米秸秆水解液发酵生产2,3-丁二醇43-52
• 3.1 材料与方法43-44
• 3.1.1 材料与试剂43
• 3.1.2 菌种43
• 3.1.3 玉米秸秆水解液的制备43-44
• 3.1.4 培养基44
• 3.1.5 实验方法44
• 3.2 实验结果与讨论44-50
• 3.2.1 酶解液中葡萄糖和木糖的比例变化对于发酵的影响44-45
• 3.2.2 玉米秸秆水解液中硫酸钠浓度对于2,3-丁二醇发酵的影响45-46
• 3.2.3 乙酸对发酵的影响46-47
• 3.2.4 副产物乙醇对于玉米秸秆水解液发酵生产2,3-丁二醇的影响47
• 3.2.5 初始pH值对发酵的影响47-48
• 3.2.6 玉米秸秆水解液浓缩后总糖浓度对发酵的影响48-49
• 3.2.7 Klebsiella oxytoca ZU-03发酵产2,3-丁二醇的时间进程49-50
• 3.3 结论50-52
• 第四章 分批补料发酵生产2,3-丁二醇52-63
• 4.1 材料与方法52-53
• 4.1.1 材料与试剂52
• 4.1.2 纤维原料及预处理52
• 4.1.3 玉米秸秆水解液的制备52
• 4.1.4 培养基52-53
• 4.1.5 摇瓶发酵和补料操作53
• 4.1.6 补料量不同时补料方案53
• 4.1.7 补料成分中碳氮比不同时补料方案53
• 4.1.8 分析检测方法53
• 4.2 实验结果与讨论53-61
• 4.2.1 初始补料时间的确定53-55
• 4.2.2 2,3-丁二醇补料发酵中合适的单次补料量55-58
• 4.2.3 氮源对于补料的影响58-61
• 4.2.3.1 补料成分中碳氮比和原培养基相同58-59
• 4.2.3.2 补料成分碳氮比不同59-61
• 4.3 结论61-63
• 第五章 纤维素原料同步糖化发酵生产2,3-丁二醇63-71
• 5.1 材料与方法63-64
• 5.1.1 主要仪器与试剂63
• 5.1.2 菌种及保藏63
• 5.1.3 纤维原料及预处理63-64
• 5.1.4 酶制剂64
• 5.1.5 培养基64
• 5.1.5.1 斜面培养基64
• 5.1.5.2 种子培养基64
• 5.1.6 菌种的制备64
• 5.1.7 同步糖化发酵(SSF)64
• 5.1.8 分析方法64
• 5.1.8.1 酶活力测定64
• 5.1.8.2 成分分析64
• 5.2 实验结果与讨论64-69
• 5.2.1 同步糖化发酵关键因子温度的确定64-65
• 5.2.2 同步糖化发酵关键因子pH的确定65-66
• 5.2.3 同步糖化发酵关键因子纤维素用量的确定66-67
• 5.2.4 纤维二糖酶用量的确定67-68
• 5.2.5 同步糖化发酵的进程68-69
• 5.3 结论69-71
• 第六章 结论与建议71-74
• 6.1 结论71-73
• 6.2 展望73-74
• 论文发表情况74-75
• 参考文献75-80

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