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玉米秸秆腐解复合菌系CSS-1的构建、菌群组成及腐解特性研究

来源:论文学术网
时间:2024-08-18 22:09:27
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玉米秸秆腐解复合菌系CSS-1的构建、菌群组成及腐解特性研究【摘要】:选育在常温下对玉米秸秆具有高效、稳定腐解功能的微生物复合菌系并分析其菌群组成,以促进我国北方农区原位还田玉米秸

【摘要】: 选育在常温下对玉米秸秆具有高效、稳定腐解功能的微生物复合菌系并分析其菌群组成,以促进我国北方农区原位还田玉米秸秆的快速腐解,推进秸秆还田应用。本研究采用限制性培养、温度梯度诱导的方法,以山西、山东、北京等省市玉米秸秆连续多年还田的土壤样品为菌源,以秸秆失重率、C/N以及CMC(羧甲基纤维素钠)酶活为筛选指标,筛选获得高效稳定的玉米秸秆腐解复合菌系CSS-1;比较复合菌系不同继代腐解秸秆的失重率、酶活以及微生物菌群的变性梯度凝胶电泳(DGGE)的菌群监测动态变化,评价CSS-1的功能及其组成稳定性;采用克隆文库法,解析复合菌系CSS-1的主要菌群组成;以复合菌系的生长曲线、pH、CMC酶活以及木聚糖酶活、揭示其腐解特性;利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术揭示复合菌系CSS-1在腐解过程中的菌群组成及其动态变化。 从山西省壶关县多年玉米秸秆连续还田的土壤中,筛选得到高效、稳定的玉米秸秆腐解复合菌系CSS-1;模拟田间腐解试验表明,在22℃条件下CSS-1处理玉米秸秆的CMC平均酶活和最高酶活比目前广泛应用的菌剂A分别提高82%和79%,其失重率比菌剂A和空白对照分别提高62.62%和173.65%,显示CSS-1在常温下能显著促进玉米秸秆的腐解的功能;CSS-1不同继代腐解秸秆功能及其菌系组成监测表明该复合菌系的稳定性;安全性评价表明该复合菌系无毒无害,具有较高的安全性。 克隆文库方法显示CSS-1优势菌群由多种具有纤维素与半纤维素降解功能的细菌和真菌构成,其细菌菌群分别归属Enterobacter、Cellulomonas、Streptomyces、Bacillaceae、Pantoe、Cellvibrio 6个属,真菌菌群归属Trichoderma、Gibberella 2个属。菌群分析结果还表明克隆文库分析方法得到的菌系组成比CSS-1平板分离培养法更全面。 玉米秸秆腐解特性试验显示,该复合菌系CSS-1的生长曲线和其CMC酶活、木聚糖酶活、pH的变化规律一致。复合菌系的整个生长腐解过程划分为三个时期,即0-4 d的对数生长期、4-10 d的稳定期、10-16 d的衰亡期。在腐解的第4 d时,各类微生物数量、pH值、木聚糖酶活呈直线上升,CMC酶活经历了一个缓慢下降的过程;在第4~10 d复合菌系中各类微生物数量同步下降后升高,此段时间CMC酶活、木聚糖酶活和pH都升直至最高值;在第10~16 d复合菌系得个生物学特性指标变化都趋向平缓。 利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)对复合菌系的菌群组成及其动态进行分析表明:该复合菌系的细菌菌群主要由18个微生物种群组成;真菌菌群主要由9个微生物种群组成;随着玉米秸秆的降解进程,其菌群构成出现了一定的变化。整个腐解过程可以划分为三个阶段:0-2 d为腐解初期,2-10 d为腐解中期,10-16 d为腐解末期,与复合菌系生长过程基本一致。在腐解初期各微生物菌群快速生长;在腐解中期纤维素分解有关的微生物Streptomyces sp.、Micrococcus sp.、Bacillus megaterium、Pseudomonas sp.、Trichoderma sp.、Fusarium sp.大量增殖后保持稳定;腐解后期一些功能菌群数量减少如Streptomyces sp.、Actinomycetales,一些兼性厌氧细菌数量逐渐增加如Clostridium sp.,而有些种群一直保持较多数量Trichoderma sp.、Fusarium sp.。 本研究还证实,所选用的Bead-beader的方法适合大批量土壤样品DNA的提取,克隆文库法和DGGE法均可用于复杂样品中细菌组成分析。 【关键词】:玉米秸秆 腐解 复合菌系 菌群组成 腐解特性
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S154.3;S513
【目录】:
  • 摘要8-10
  • Abstract10-13
  • 1 引言13-51
  • 1.1 秸秆资源概述13-14
  • 1.2 秸秆资源的利用途径14-18
  • 1.2.1 秸秆肥料化技术14-16
  • 1.2.1.1 秸秆直接还田14-15
  • 1.2.1.2 秸秆间接还田15-16
  • 1.2.2 秸秆饲料化技术16
  • 1.2.3 秸秆能源化技术16-17
  • 1.2.4 秸秆材料化技术17-18
  • 1.3 秸秆资源化利用存在的问题18-19
  • 1.4 秸秆还田效应的研究进展19-25
  • 1.4.1 秸秆还田对土壤理化性状的影响19-22
  • 1.4.2 秸秆还田对土壤生物肥力的影响22-24
  • 1.4.3 秸秆还田对作物产量的影响24-25
  • 1.5 植物秸秆组成特点及其生物降解特性25-33
  • 1.5.1 纤维素的化学组成及其生物降解26-30
  • 1.5.2 半纤维素的化学组成及其生物降解30-31
  • 1.5.3 木质素的化学组成及生物降解31-33
  • 1.6 分解木质纤维素的微生物33-38
  • 1.7 利用复合菌系降解木质纤维素的研究进展38-42
  • 1.8 分子生物学技术在复合菌系研究中的应用42-47
  • 1.8.1 克隆文库分析法43-44
  • 1.8.2 变性梯度凝胶电泳(DGGE)44-47
  • 1.9 研究目的意义47-48
  • 1.9.1 研究意义47
  • 1.9.2 研究目标47-48
  • 1.10 研究内容、技术路线及方法48-51
  • 1.10.1 研究内容48-49
  • 1.10.2 技术路线49
  • 1.10.3 研究方法49-51
  • 2 材料与方法51-66
  • 2.1 材料来源51-52
  • 2.2 主要试剂52-55
  • 2.2.1 主要生化试剂52
  • 2.2.2 酶活测定的主要试剂52-53
  • 2.2.3 DNA 提取试剂53-54
  • 2.2.4 琼脂糖缓冲液和试剂54
  • 2.2.5 DGGE 缓冲液和试剂54-55
  • 2.3 主要仪器55
  • 2.4 培养基55-56
  • 2.4.1 复合菌系筛选培养基55-56
  • 2.4.2 其它常规培养基56
  • 2.5 试验方法56-66
  • 2.5.1 腐解复合菌系筛选方法56-57
  • 2.5.1.1 腐解复合菌系的富集培养56-57
  • 2.5.1.2 腐解复合菌系的限制性诱导培养57
  • 2.5.1.3 腐解复合菌系的降温诱导筛选57
  • 2.5.2 秸秆失重率测定57
  • 2.5.3 CMC 酶活的测定57-58
  • 2.5.4 木聚糖酶活测定58
  • 2.5.5 玉米秸秆腐解物料C/N 的测定58
  • 2.5.6 玉米秸秆腐解复合菌系CSS-1 中纯菌株的分离58-59
  • 2.5.7 总DNA 的提取与纯度检测59
  • 2.5.8 DGGE 所需聚合酶链式反应(PCR)扩增条件59-61
  • 2.5.9 变性梯度凝胶电泳(DGGE)61-62
  • 2.5.9.1 DGGE 的操作61
  • 2.5.9.2 DGGE 条带回收61-62
  • 2.5.10 复合菌系的安全性评价62
  • 2.5.11 克隆文库的构建方法62-65
  • 2.5.11.1 16S/18S rDNA 的PCR 扩增及PCR 产物纯化62-63
  • 2.5.11.2 目的产物的连接63
  • 2.5.11.3 连接反应产物的转化步骤63-64
  • 2.5.11.4 阳性克隆的筛选64-65
  • 2.5.11.5 ARDRA 分型65
  • 2.5.12 复合菌系CSS-1 对玉米秸秆腐解特性分析方法65
  • 2.5.13 玉腐解过程中复合菌系菌群组成的动态变化分析方法65-66
  • 3 结果与分析66-93
  • 3.1 玉米秸秆常温高效腐解复合菌系CSS-1 的选育66-72
  • 3.1.1 玉米秸秆腐解复合菌系CSS-1 的筛选66
  • 3.1.2 复合菌系CSS-1 腐解效果66-69
  • 3.1.3 复合菌系CSS-1 的稳定性69-72
  • 3.1.3.1 功能稳定性69-71
  • 3.1.3.2 菌群组成稳定性71-72
  • 3.1.4 复合菌系CSS-1 的安全性评价72
  • 3.2 克隆文库法分析复合菌系CSS-1 细菌/真菌组成72-83
  • 3.2.1 克隆文库构建72-78
  • 3.2.2 克隆文库分析78-81
  • 3.2.2.1 克隆文库的评估78
  • 3.2.2.2 克隆文库的序列分析78-81
  • 3.2.3 复合菌系CSS-1 中纯菌株的分离81-83
  • 3.3 复合菌系CSS-1 对玉米秸秆腐解特性83-93
  • 3.3.1 腐解过程中的pH 值变化83-84
  • 3.3.2 腐解过程中的可培养微生物数量的变化84
  • 3.3.3 腐解过程中的CMC 酶活、木聚糖酶活的变化84-85
  • 3.3.4 复合菌系CSS-1 腐解过程中菌群的动态变化85-93
  • 4 讨论93-96
  • 4.1 玉米秸秆常温高效腐解菌复合菌系CSS-1 的选育及其组成分析93
  • 4.2 克隆文库法分析复合菌系CSS-1 细菌/真菌组成93-94
  • 4.3 复合菌系CSS-1 对玉米秸秆腐解特性94-96
  • 5 结论96-98
  • 参考文献98-110
  • 致谢110-111
  • 附录111-112
  • 攻读学位期间发表论文情况112


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