玉米秸秆生物炼制丁二酸的研究

【摘要】：丁二酸（琥珀酸）是一种重要的C4平台化合物，它作为有机化工的基本原材料广泛应用于食品医药表面活性剂清洁剂绿色溶剂生物可降解塑料等领域生物基丁二酸做为一种化工原材料的替代品，在石油基大宗化学品市场中日益受到重视，被美国能源部评估为前12种应该优先考虑的化学品之一秸秆是一种重要的木质纤维素类可再生资源，在我国资源非常丰富，每年产量约达7亿多吨，除少量被草食动物间接消化利用外，大部分以焚烧或微生物无用分解方式进入自然生态循环系统开展秸秆生物炼制丁二酸的研究，有利于减少传统化学合成中对化石原料的依赖，缓解大气的温室效应，促进碳氢化合物经济向碳水化合物经济转型；有利于促进秸秆的高值化利用，有利于解决―三农‖问题，增加农民收入本文围绕秸秆生物炼制丁二酸中的微生物菌株改造酶转化发酵策略和纤维素酶回用三个方面的关键问题，进行以下研究： (1)对丁二酸产生菌琥珀酸放线杆菌A. succinogenes CGMCC1593的pH温度和产酸三个表型进行改进首先，建立了基于―先选相对优势组群再选优势菌株‖策略的96孔板高效筛选法，通过选择性平板生长96孔培养板发酵HPLC浓缩检测和摇瓶复筛，实现了从大样本中高效筛选目标菌株其次，采用基因组改组方法，选育得到耐酸菌株F3-20和高产菌F3-3-f；采用温度驯化的方法，得到耐温菌株2-b F3-20在培养基pH5.6的条件下生长，菌体OD值提高了6倍，摇瓶产酸提高了32%；F3-3-f补料分批发酵，产丁二酸可达到94g/L，产率84%，生产强度1.96g/L/h；菌株2-b在40℃下分批发酵，产丁二酸可达到40.2g/L，产率89%，糖利用率92%，生产强度1.11g/L/h A. succinogenes的耐酸表型与丁二酸产量表型具有一定的相容性，但其温度耐受表型与产量表型的相容性相对较差再次，测定葡萄糖代谢关键酶活性发现：改组菌F3-3-f的EMP途径和C4途径中的部分酶（PEP羧化激酶己糖激酶1,6-二磷酸果糖醛缩酶和延胡羧酸酶）的活性增加，而C3途径中的部分酶（乙酸激酶丙酮酸激酶）的活性减少扩增片段长度多态性分析表明改组菌与出发菌在基因组上存有明显差异 (2)探讨A. succinogenes发酵木糖与秸秆水解糖的特性以木糖混合糖和秸秆水解糖为碳源，摇瓶和发酵罐实验结果表明：A. succinogenes对木糖利用率高，但副产物乙酸浓度高，丁二酸产率低；混合糖或秸秆水解糖发酵时，其中的木糖和葡萄糖同时被利用，乙酸浓度高的程度得到一定缓解；以秸秆水解糖为底物，5L发酵罐中补料分批发酵48h产丁二酸77.6g/L乙酸9.4g/L糖利用率96%丁二酸产率84%生产强度1.62g/L/h比较单纯木糖和单纯葡萄糖发酵20h的菌体生长底物消耗和产物形成速率，认为木糖代谢过程乙酸浓度偏高可能与ATP需求有关，而丁二酸产率偏低可能与代谢过程还原力减少有关 （3）系统研究A. succinogenes秸秆同步糖化（共）发酵（SSF）策略首先，考察β-葡萄糖苷酶（βG）和木聚糖酶对纤维素酶降解秸秆的协同作用，在纤维素酶中，按每克预处理秸秆（PCS）补充10CBU的βG或50-100U的木聚糖酶，秸秆水解率提高30%左右；摇瓶SSF产丁二酸浓度可提高2.5倍，得出：对于不同来源的工业纤维素酶可采用适当补充βG和木聚糖酶的方式进行秸秆水解或SSF其次，底物（PCS）浓度实验表明：合适的底物浓度为65-80g PCS/L，SSF最适底物浓度比秸秆水解的最适底物浓度略高再次，对SSF参数进行了系统表征SSF过程中，糖浓度维持在较低水平；纤维素酶活性与秸秆颗粒质量呈现相同的减少趋势，两者在发酵前期（12h内）快速衰减至一半左右，然后基本维持不变；而βG和木聚糖酶的活性基本维持不变；丁二酸与乙酸的质量比较低（4.5左右）进一步，通过采用预水解SSF工艺，有效提高了发酵过程菌体浓度，丁二酸浓度从45.4g/L提高到47.9g/L，产率从0.567g/g PCS提高到0.598g/g PCS，结合40℃发酵，丁二酸浓度达到52.4g/L，对秸秆产率为0.655g/g PCS，丁二酸/乙酸提高到5.6然后，比较分步水解发酵（SHF）和SSF的发酵参数及酶耗，得出两种发酵工艺路线各有利弊，总体差距不明显，采用自制T. reesei发酵液以及预水解同步糖化发酵工艺相对略好，但是酶的用量与价格是决定秸秆生物炼制丁二酸的主导因素 （4）针对纤维素酶的回收利用，初步研究磁性固定化β-葡萄糖苷酶pH值敏感型可逆可溶性聚合物Eudragit L-100固定化纤维素酶的方法，以及固定化酶在水解秸秆中的应用首先，通过条件优化，制得磁性固定化βG，固定化酶活力和固定化酶收率分别达到6.67CBU/g与91.0%红外光谱和扫描电镜图证实壳聚糖Fe3O4和酶有机地结合在一起；Fe3O4除了提供磁性外，还促进了壳聚糖微球对酶的吸附与游离酶相比，固定化βG的最适pH向低pH偏移了0.3，表观米氏常数略有降低，说明固定化酶对底物的亲和性没有下降在协同纤维素酶秸秆水解体系中，固定化βG稳定性良好，反复使用8次（288h），平均秸秆水解率为76.9%其次，优化Eudragit L-100固定化纤维素酶条件，制得固定化酶的酶活力为5FPU/g，固定化酶收率16.2%；固定化酶的溶解pH范围比载体的溶解pH范围略向碱性偏移，酶反应最适pH也比游离酶的最适pH略向碱性偏移在秸秆水解体系中，其水解率仅比游离酶低3%，反复利用10次（400h），平均水解率为80.4%，没有明显下降的趋势当两种固定化酶同时用于秸秆水解体系时，水解时间略有延长，重复使用7次(420h），水解率仍有75%，展现了良好的操作稳定性和应用的前景 【关键词】：生物炼制 丁二酸 秸秆 分步糖化发酵 同步糖化发酵 固定化 β-葡萄糖苷酶 固定化纤维素酶 琥珀酸放线杆菌
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：TQ921.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 绪论11-33
• 1.1 前言11-13
• 1.2 微生物发酵生产丁二酸的研究进展13-23
• 1.2.1 发酵产丁二酸微生物菌种研究现状13-19
• 1.2.2 生物质原料生产丁二酸的研究现状19-23
• 1.3 秸秆生物炼制丁二酸的关键技术23-31
• 1.3.1 秸秆原料生产丁二酸的策略24-25
• 1.3.2 基于基因组改组技术的琥珀酸放线杆菌改造策略25-28
• 1.3.3 基于固定化纤维素酶的策略28-31
• 1.4 本课题研究意义与研究内容31-33
• 1.4.1 研究意义31
• 1.4.2 研究内容31-33
• 第二章 耐酸耐温高产 A.succinogenes 菌种选育33-52
• 2.1 引言33-34
• 2.2 材料与方法34-38
• 2.2.1 菌株34
• 2.2.2 化学试剂34
• 2.2.3 主要实验仪器34-35
• 2.2.4 主要溶液与培养基35
• 2.2.5 诱变方法35
• 2.2.6 筛选方法35-36
• 2.2.7 基因组改组方法36
• 2.2.8 发酵方法36
• 2.2.9 AFLP 分析 DNA 多态性36
• 2.2.10 分析方法36-38
• 2.3 结果与讨论38-51
• 2.3.1 高通量筛选模型的建立38-40
• 2.3.2 产丁二酸耐酸菌株选育40-42
• 2.3.3 高产丁二酸菌株选育42-43
• 2.3.4 产丁二酸耐温菌选育43-44
• 2.3.5 A. succinogenes 高产丁二酸菌株的发酵特性44-48
• 2.3.6 高产 A. succinogenes 突变株葡糖糖代谢关键酶的活性比较48-49
• 2.3.7 A. succinogenes 突变株 AFLP 多态性分析49-51
• 2.4 本章小结51-52
• 第三章 A. succinogenes 发酵木糖与秸秆水解糖浆生产丁二酸52-61
• 3.1 引言52-53
• 3.2 材料与方法53
• 3.2.1 材料53
• 3.2.2 培养基53
• 3.2.3 发酵方法53
• 3.2.4 分析方法53
• 3.3 结果与讨论53-60
• 3.3.1 不同浓度木糖葡萄糖摇瓶发酵产丁二酸53-54
• 3.3.2 木糖-葡萄糖混合糖秸秆水解糖摇瓶发酵产丁二酸54-56
• 3.3.3 木糖木糖-葡萄糖混合糖在 5 L 发酵罐中发酵产丁二酸56-57
• 3.3.4 F3-3-f 秸秆水解糖 5L 发酵罐补料发酵57
• 3.3.5 A.succinogenes 木糖代谢机理初探57-60
• 3.4 本章小结60-61
• 第四章 玉米秸秆制备丁二酸：同步糖化（共）发酵策略61-78
• 4.1 引言61-62
• 4.2 材料与方法62-64
• 4.2.1 菌种62
• 4.2.2 主要试剂62
• 4.2.3 主要实验仪器62
• 4.2.4 秸秆预处理方法62
• 4.2.5 发酵方法62
• 4.2.6 秸秆的酶水解方法62-63
• 4.2.7 发酵液菌体生长测定方法63-64
• 4.2.8 分析方法64
• 4.3 结果与讨论64-77
• 4.3.1 β-葡萄糖苷酶（βG）对秸秆的协同水解64-65
• 4.3.2 木聚糖酶对秸秆的协同水解65-66
• 4.3.3 SSF 中工业纤维素酶的复配66-68
• 4.3.4 不同秸秆浓度对秸秆水解与 SSF 的影响68-70
• 4.3.5 A.succinogenes 同步糖化发酵秸秆产丁二酸的过程表征70-72
• 4.3.6 预水解同步糖化发酵工艺72-74
• 4.3.7 同步糖化发酵与分步糖化发酵比较74-77
• 4.4 本章小结77-78
• 第五章 固定化β-葡萄糖苷酶与纤维素酶及其水解秸杆纤维素初探78-91
• 5.1 引言78
• 5.2 材料与方法78-80
• 5.2.1 材料78-79
• 5.2.2 主要仪器79
• 5.2.3 实验方法79
• 5.2.4 分析方法79-80
• 5.3 结果与讨论80-90
• 5.3.1 壳聚糖固定化βG 的制备80-82
• 5.3.2 磁性壳聚糖固定化βG 的制备与特征82-83
• 5.3.3 磁性壳聚糖固定化βG 的稳定性83-84
• 5.3.4 磁性固定化βG 的动力学性质84-85
• 5.3.5 磁性固定化βG 耦合纤维素酶水解秸杆85-86
• 5.3.6 Eudragit L-100 固定化纤维素酶的制备86-87
• 5.3.7 Eudragit L-100 固定化纤维素酶的特性87-89
• 5.3.8 Eudragit L-100 固定化纤维素酶水解秸杆及其操作稳定性89
• 5.3.9 两种固定化酶水解秸秆尝试89-90
• 5.4 本章小结90-91
• 第六章 结论与展望91-93
• 论文创新点93-94
• 致谢94-95
• 参考文献95-108
• 附录Ⅰ108-110
• 附录Ⅱ：作者在攻读博士学位期间发表的相关论文110

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