纤维素酶的研究及在秸秆养鹿中的应用初探

【摘要】：全世界每年大约形成1000~2000亿t植物有机物质,其中有一半是纤维素物质。我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿t,工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物。这些废弃物既没有得到充分的利用,又污染环境,因此合理开发和科学利用这一丰厚的天然资源是各国政府及科学家一直致力于且投入大量资金及人力进行研究开发的重点领域。而目前对农作物秸秆的利用还未达到令人满意的水平,其主要原因是缺乏对农作物秸秆这种天然纤维素完全降解的高活性菌株。利用产纤维素酶的微生物分解废弃物(如农作物秸秆)不仅可以减少污染,还可以节省能源。利用纤维素酶使大量纤维素资源和城市纤维素废料转变成人类所需的物质,具有积极的深远意义。到目前为止,纤维素酶已广泛应用于工、农、畜、医等领域中,并取得了初步成效,特别是在饲用纤维素酶方面。我国对纤维素酶的研究虽然有几十年的历史,但由于纤维素酶活性不高,生产成本过高而导致其应用仍受到限制。因此选育高活性的纤维素酶是我国酶制剂研究的一项重要任务。 我国是一个农业大国,秸秆资源非常丰富,每年产量达数亿吨。但这丰富的秸秆资源在我国的利用率却很低。目前对秸秆的利用,仅限于还田以及掺入肥料发酵,这种利用无法解决大量秸秆的综合利用问题[1]。玉米秸秆是纤维组分含量很高的农作物残留物,若能将这些秸秆纤维废弃物经微生物转化为简单糖类或蛋白质等产品,既可以解决环境污染,又可以作为饲料,缓解粮食危机。因此,不断地分离和选育纤维分解高产菌株是一项重要而有意义的工作[2,3]。利用纤维素分解菌生产发酵饲料是当前饲料业的一个发展方向,它可将纤维素分解为牲畜可利用的糖,同时增加饲料中蛋白质的含量。 本课题以碱处理过的辽丰2号玉米秸秆粉为原料,采用常规方法从山坡土壤、柴禾堆下及菜地等微生物丰富的土样中,大量采集并筛选分离后得出1株纤维素酶活性较高且性质较稳定的优良菌株,经初步鉴定为绿色木霉。采用摇床液体发酵试验方法,利用产纤维素酶菌株对秸秆进行发酵,并测定CMC酶活,FPA酶活,粗纤维及粗蛋白的含量,从而确定该菌株的最优产酶条件。 液体发酵产酶特性的结果表明,最优培养基组成中秸秆和麦麸的比例为3:1,碳源总量为15g/L。培养基中1.7g/L硫酸铵和0.5g/L蛋白胨混合为实验的最佳氮源,最佳接种量为3%,最适酶解pH值为6.0,最适酶解温度为30℃,最佳培养时间为6d。此外,金属离子、维生素、表面活性剂等均是影响酶活性和纤维素分解率的重要因素。在优化培养条件的实验中,金属离子Na+对菌株产酶和纤维素的分解有明显促进的作用,而Cu2+则能明显抑制纤维素酶活性和纤维素的分解。添加维生素B2没有使酶活性提高,但却可以提高纤维素的分解率,使粗蛋白含量增加;而添加维生素C使酶活性和纤维素的分解率均明显升高。在培养介质中添加0.2%吐温-80(Tween-80)可以提高纤维素酶酶活和产率。 此外,纤维素酶是一种诱导酶类,纤维素类物质的分解需要多种微生物的联合作用。在该菌株分别与酿酒酵母和青霉的混合共发酵实验中,纤维素酶活和对纤维素的分解能力均大幅度提高,粗蛋白含量也有所增加。其中以该菌株与青霉的混合效果最佳,说明青霉和木霉之间具有比较强的协同作用,可以相互补充,从而促进纤维素类物质的分解。 本实验还将所选的绿色木霉与青霉混合制成种子液,在液体发酵罐中进行10升自控式批量发酵,搅拌速度控制在800r/min,30℃下培养6d后测得酶液的CMC酶活可达4.6955IU/mL,FPA酶活为1.4175 IU/mL,粗纤维的含量为11.01%,粗蛋白含量为20.66%,可以说是较理想的结果。 以所得纤维素粗酶液喷洒的玉米秸秆和培养基残余物作为粗饲料的饲喂试验表明,该饲料可使成年公鹿60d平均增重29.56kg,平均日增重达492.71g,且产茸量也由1.3kg提高到1.44kg,鹿茸产量提高了10.77%。 总之,本实验的研究结果对液态发酵生产纤维素酶有一定的指导作用,为农作物秸秆的开发利用提供了依据,也为草食动物饲料的研究开发奠定了基础。 【关键词】：纤维素 纤维素酶 玉米秸秆 饲料 养鹿
【学位授予单位】：辽宁石油化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：S825
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-20
• 1 前言20-22
• 2 文献综述22-39
• 2.1 降解秸秆的研究进展22-24
• 2.1.1 秸秆的主要成分22
• 2.1.2 降解秸秆的酶学机理22
• 2.1.3 微生物分解秸秆制剂的应用22-23
• 2.1.3.1 发酵法22
• 2.1.3.2 SCP 法22-23
• 2.1.3.3 酶解法23
• 2.1.4 秸秆饲料开发的状况23-24
• 2.2 纤维素的研究24-25
• 2.2.1 纤维素概述24
• 2.2.2 纤维素的化学组成及结构24-25
• 2.3 纤维素酶的研究25-38
• 2.3.1 纤维素酶的组成25-26
• 2.3.1.1 葡聚糖内切酶25
• 2.3.1.2 葡聚糖外切酶25
• 2.3.1.3 β-葡萄糖苷酶25-26
• 2.3.2 纤维素酶的分子结构与功能26
• 2.3.3 纤维素酶的降解26-27
• 2.3.3.1 对纤维素分子的吸附作用26
• 2.3.3.2 纤维素酶中单个组分的作用26-27
• 2.3.3.3 纤维素酶的协同降解作用27
• 2.3.4 纤维素酶的营养作用机理27-28
• 2.3.4.1 摧毁植物细胞壁，释放胞内养分27
• 2.3.4.2 补充草食动物内源酶的不足，刺激内源酶的分泌27-28
• 2.3.4.3 消除饲料中的抗营养因子28
• 2.3.4.4 对小肠的作用28
• 2.3.4.5 其他28
• 2.3.5 产纤维素酶微生物的研究28-30
• 2.3.6 纤维素酶的开发和生产30-31
• 2.3.6.1 菌株选育30
• 2.3.6.2 发酵培养30-31
• 2.3.6.3 酶提取31
• 2.3.7 饲用纤维素酶的应用方法31
• 2.3.8 纤维素酶研究的技术进展31-33
• 2.3.8.1 新菌株的选育31-32
• 2.3.8.2 产酶菌株的诱变育种32
• 2.3.8.3 DNA 体外重组技术32
• 2.3.8.4 基因定位突变技术32-33
• 2.3.8.5 细胞融合技术33
• 2.3.9 纤维素酶在饲料工业中的应用状况33-36
• 2.3.9.1 纤维素酶在畜牧生产中的应用现状33-36
• 2.3.9.1.1 在牛日粮中的应用33-34
• 2.3.9.1.2 在羊日粮中的应用34
• 2.3.9.1.3 在养猪业的应用34-35
• 2.3.9.1.4 在养禽业的应用35-36
• 2.3.9.2 纤维素酶在开发饲料资源方面的应用36
• 2.3.9.2.1 青贮饲料36
• 2.3.9.2.2 纤维素酶酶解纤维废弃物，生产单细胞蛋白36
• 2.3.9.3 在治疗方面的应用36
• 2.3.10 纤维素酶存在的问题及发展前景36-38
• 2.3.10.1 纤维素酶存在的问题37
• 2.3.10.1.1 饲用纤维素酶的检测方法有待进一步研究37
• 2.3.10.1.2 纤维素酶制剂的生产方法有待进一步研究37
• 2.3.10.1.3 纤维素酶的作用机制有待进一步研究37
• 2.3.10.2 纤维素酶研究展望37-38
• 2.4 实验目的及意义38-39
• 3 实验部分39-53
• 3.1 实验原理39-40
• 3.1.1 菌种筛选原理39
• 3.1.2 发酵原理39-40
• 3.2 实验器材与材料40-42
• 3.2.1 实验器材40
• 3.2.1.1 主要仪器与设备40
• 3.2.1.2 实验器皿40
• 3.2.2 实验材料40-42
• 3.2.2.1 样品来源40-41
• 3.2.2.2 秸秆来源41
• 3.2.2.3 培养基41
• 3.2.2.4 蛋白质的测定41
• 3.2.2.5 滤纸分解度的观察41
• 3.2.2.6 CMC 酶活性的测定41
• 3.2.2.7 FPA 酶活性的测定41-42
• 3.2.2.8 天然纤维素酶活性的测定42
• 3.2.2.9 纤维素的测定42
• 3.3 实验方法42-47
• 3.3.1 高产纤维素酶菌株的筛选42
• 3.3.1.1 初筛42
• 3.3.1.2 增殖与复筛42
• 3.3.1.3 菌种的分离42
• 3.3.2 秸秆纤维素的制备42-43
• 3.3.3 酶活的测定43
• 3.3.4 菌株的初步鉴定43
• 3.3.5 菌株的传代试验43
• 3.3.6 供试菌种孢子悬液的制备和稀释43
• 3.3.7 考察发酵条件对酶解效果的影响43-45
• 3.3.7.1 培养时间对菌株酶解效果的影响43
• 3.3.7.2 碳源对菌株酶解效果的影响43-44
• 3.3.7.3 氮源对菌株酶解效果的影响44
• 3.3.7.4 接种量对菌株酶解效果的影响44
• 3.3.7.5 发酵起始pH 对菌株酶解效果的影响44
• 3.3.7.6 温度对菌株酶解效果的影响44
• 3.3.7.7 金属离子对菌株酶解效果的影响44-45
• 3.3.7.8 表面活性剂对菌株酶解效果的影响45
• 3.3.7.9 维生素对菌株酶解效果的影响45
• 3.3.8 纤维素分解菌之间的相互作用45
• 3.3.9 液体发酵罐扩大培养45
• 3.3.10 纤维素酶在饲养梅花鹿中的试验初探45-47
• 3.3.10.1 试验地点45
• 3.3.10.2 试验材料45-46
• 3.3.10.3 试验方法46-47
• 3.4 分析方法47-53
• 3.4.1 玉米秸秆成分的测定方法47-48
• 3.4.1.1 水分的测定方法47
• 3.4.1.2 灰分的测定方法47
• 3.4.1.3 蛋白质的测定47-48
• 3.4.2 还原糖含量的测定48-51
• 3.4.2.1 原理48
• 3.4.2.2 操作方法48-50
• 3.4.2.3 试剂的配制50
• 3.4.2.4 羧甲基纤维素（CMC）酶活的测定50-51
• 3.4.2.5 滤纸酶活（FPA）的测定51
• 3.4.2.6 天然纤维素酶活的测定51
• 3.4.2.7 滤纸分解度的观察51
• 3.4.3 纤维素的测定51-53
• 3.4.3.1 中性洗涤剂的配制51-52
• 3.4.3.2 操作方法52-53
• 4 结果与讨论53-78
• 4.1 实验所用秸秆的原始成分测定53
• 4.2 纤维素分解菌的分离纯化结果53-54
• 4.3 酶活力测定结果54-56
• 4.4 H-6 菌株的初步鉴定56-57
• 4.5 传代试验57
• 4.6 发酵条件对酶解效果的影响57-74
• 4.6.1 培养时间对对酶解效果的影响57-59
• 4.6.2 碳源对酶解效果的影响59-64
• 4.6.2.1 不同含量的玉米秸秆对酶解效果的影响59-61
• 4.6.2.2 不同含量的麦麸对酶解效果的影响61-62
• 4.6.2.3 秸秆比例对液态混合培养酶解效果的影响62-64
• 4.6.3 氮源对酶解效果的影响64-66
• 4.6.4 接种量对酶解效果的影响66-68
• 4.6.5 pH 对酶解效果的影响68-69
• 4.6.6 温度对酶解效果的影响69-71
• 4.6.7 金属离子对酶解效果的影响71-72
• 4.6.8 表面活性剂（Tween-80）对酶解效果的影响72-73
• 4.6.9 维生素对酶解效果的影响73-74
• 4.7 不同菌株之间的相互作用74-75
• 4.8 液体发酵罐扩大培养75-76
• 4.9 纤维素酶在饲养梅花鹿中的试验初探76-78
• 5 结论78-80
• 参考文献80-86
• 致谢86-87
• 攻读学位期间发表的学术论文目录87

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