秸秆反应堆中淡紫拟青霉与根结线虫、尖孢镰刀菌互作的研究

【摘要】：黄瓜是设施蔬菜中受到连作影响最重的蔬菜,连作导致了黄瓜根结线虫、枯萎病等病害的加重。淡紫拟青霉是重要的生防菌,可有效防治黄瓜根结线虫,抑制导致黄瓜枯萎病的尖孢镰刀菌。秸秆反应堆技术应用在温室作物的种植中,可以改善土壤中微生态环境,使其朝着有利于作物生长的方向发展。但目前对秸秆反应堆中生防菌种群变化以及与病原物之间的互作关系还缺乏深入研究。本研究明确了秸秆反应堆技术对生防菌(淡紫拟青霉)与病原物(根结线虫和尖孢镰刀菌)之间互作关系的影响,为生防菌的生态调控机理研究和生防效果的评价提供理论依据。 本研究的主要结果如下： 1、通过RAPD技术设计了淡紫拟青霉特异性引物。采用随机引物对YES-2-14以及近缘菌株的基因组DNA多态性进行分析,扩增到仅出现于淡紫拟青霉基因图谱中的特异性条带(大小为203bp)。根据YES-2-14的RAPD标记中核苷酸序列设计引物并用于菌株特异性条带的筛选,从中挑选出1对特异性最好的引物转化为SCAR引物,扩增产物大小为195bp。通过PCR进一步验证SCAR引物的特异性,结果仅有淡紫拟青霉菌株可扩增到相应的SCAR条带,表明该引物可用于土壤中淡紫拟青霉的快速鉴别。 2、建立了淡紫拟青霉荧光定量检测体系。利用淡紫拟青霉YES-2-14菌株的RAPD克隆质粒为标准物质,建立标准曲线,相关系数为0.995。经过土壤样品试验,得出相对标准曲线相关系数为0.9977,表明所建立的淡紫拟青霉荧光定量检测体系可用于土壤中淡紫拟青霉的准确定量。 3、建立了尖孢镰刀菌荧光定量检测体系。利用尖孢镰刀菌T7-1-3的阳性克隆质粒为标准物质,建立了标准曲线,相关系数为0.995。经过土壤样品试验,得出相对标准曲线相关系数为0.9873。 4、建立了秸秆反应堆,研究了秸秆反应堆对淡紫拟青霉与根结线虫、尖孢镰刀菌互作关系的影响。复合病圃和线虫病圃中,秸秆反应堆处理的根围土中淡紫拟青霉菌量与只加生防菌的处理中淡紫拟青霉菌量有显著性差异(p=0.05),根结线虫的数量比只加生防菌的处理中少,这说明秸秆反应堆能促进淡紫拟青霉的增殖,同时增强了淡紫拟青霉对根结线虫的抑制作用；秸秆反应堆处理后,复合病圃根围土中尖孢镰刀菌菌量与只加生防菌的处理中尖孢镰刀菌菌量差异不显著(p=0.05),说明秸秆反应堆处理后,淡紫拟青霉对尖孢镰刀菌的抑制作用没有增强。 【关键词】：秸秆反应堆 淡紫拟青霉 根结线虫 尖孢镰刀菌 SCAR分子标记
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：S476
【目录】：

• 摘要10-11
• Abstract11-13
• 1. 引言13-21
• 1.1 淡紫拟青霉概述13
• 1.2 淡紫拟青霉对根结线虫的生物防治作用13-14
• 1.2.1 根结线虫病害13
• 1.2.2 淡紫拟青霉对根结线虫的生防作用13-14
• 1.3 淡紫拟青霉对黄瓜枯萎病的生物防治作用14-15
• 1.3.1 黄瓜枯萎病害14-15
• 1.3.2 淡紫拟青霉对尖孢镰刀菌的生防作用15
• 1.4 秸秆反应堆技术在棚室作物上的应用15-16
• 1.4.1 秸秆反应堆概述15
• 1.4.2 秸秆反应堆技术的效应15-16
• 1.4.3 秸秆反应堆技术在温室作物中的应用16
• 1.5 土壤微生物生态学研究进展16-18
• 1.5.1 传统的生态学研究方法16
• 1.5.2 分子生物学技术在土壤生态学研究中的应用16-18
• 1.6 荧光定量PCR在植病生防中的应用18-19
• 1.6.1 荧光定量PCR概述18-19
• 1.6.2 荧光定量PCR技术在生物防治中的应用19
• 1.7 本研究的意义19-20
• 1.8 技术路线20-21
• 2. 材料与方法21-30
• 2.1 试验材料和仪器21-22
• 2.1.1 供试菌株21
• 2.1.2 主要试剂和载体21
• 2.1.3 主要培养基21-22
• 2.1.4 仪器设备22
• 2.2 淡紫拟青霉YES-2-14荧光定量体系的建立22-27
• 2.2.1 菌株培养与菌丝收集22
• 2.2.2 基因组DNA的提取22
• 2.2.3 淡紫拟青霉菌株YES-2-14和供试菌株基因组DNA多态性分析22-23
• 2.2.4 YES-2-14菌株RAPD产物的转化23-24
• 2.2.5 淡紫拟青霉菌株YES-2-14特异性引物的设计及筛选24
• 2.2.6 引物特异性的验证24-25
• 2.2.7 SCAR引物RT-PCR标准曲线的制作25-26
• 2.2.8 土壤中梯度添加YES-2-14菌丝的相对标准曲线的制作26-27
• 2.3 尖孢镰刀菌荧光定量体系的建立27-28
• 2.3.1 基因组DNA的提取27
• 2.3.2 引物设计及特异性分析27
• 2.3.3 PCR产物的纯化与转化27
• 2.3.4 重组质粒浓度测定及DNA拷贝数标准曲线的制作27
• 2.3.5 土壤中梯度添加T 7-1-3菌丝的相对标准曲线的制作27-28
• 2.4 秸秆反应堆的建立28
• 2.5 病圃的建立及种植28
• 2.5.1 病圃的建立28
• 2.5.2 黄瓜苗和辣椒苗的种植28
• 2.6 淡紫拟青霉、尖孢镰刀菌、根结线虫的监测28-29
• 2.6.1 土壤中淡紫拟青霉的定量监测28-29
• 2.6.2 土壤中尖孢镰刀菌的定量监测29
• 2.6.3 线虫数量监测29
• 2.7 生物量及根结线虫病情指数调查29
• 2.8 统计分析29-30
• 3. 结果与分析30-46
• 3.1 淡紫拟青霉菌株YES-2-14荧光定量PCR体系的建立30-34
• 3.1.1 淡紫拟青霉多态性分析30
• 3.1.2 YES-2-14菌株特异性引物的设计和筛选30
• 3.1.3 SCAR引物的特异性验证30-31
• 3.1.4 YES-2-14荧光定量PCR体系的建立31-34
• 3.2 尖孢镰刀菌T 7-1-3荧光定量PCR体系的建立34-37
• 3.2.1 尖孢镰刀菌T 7-1-3重组质粒的鉴定34-35
• 3.2.2 T 7-1-3标准曲线的制作35-36
• 3.2.3 梯度添加T 7-1-3菌丝的土壤样品定量检测36-37
• 3.3 秸秆反应堆对线虫病圃中淡紫拟青霉与根结线虫互作关系的影响37-40
• 3.3.1 根围土中淡紫拟青霉动态变化37
• 3.3.2 深层土中淡紫拟青霉的动态变化37-38
• 3.3.3 根结线虫和线虫卵的变化38-39
• 3.3.4 植株的茎粗、株高、地上部分鲜重的调查39
• 3.3.5 病情指数的调查39-40
• 3.4 秸秆反应堆对复合病圃中淡紫拟青霉与根结线虫、尖孢镰刀菌互作的影响40-44
• 3.4.1 根围土中淡紫拟青霉的动态变化40
• 3.4.2 深层土中淡紫拟青霉的动态变化40-41
• 3.4.3 根结线虫和线虫卵的变化41-42
• 3.4.4 尖孢镰刀菌的动态变化42-43
• 3.4.5 黄瓜茎高、茎粗、地上部分鲜重的调查43
• 3.4.6 病情指数调查43-44
• 3.5 秸秆反应堆对辣椒疫霉病圃中淡紫拟青霉动态变化的影响44-46
• 3.5.1 根围土中淡紫拟青霉的动态变化44
• 3.5.2 深层土中淡紫拟青霉动态变化44-46
• 4. 讨论46-48
• 4.1 秸秆反应堆技术在棚室作物中的应用46
• 4.2 分子生物学技术在淡紫拟青霉研究中的应用46-47
• 4.3 荧光定量PCR技术在淡紫拟青霉研究中的应用47
• 4.4 秸秆反应堆中淡紫拟青霉、根结线虫和尖孢镰刀菌互作的种群动态关系47-48
• 5. 结论48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-55
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文55

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