玉米秸秆木质素降解菌的筛选鉴定及发酵条件研究

【摘要】：随着经济的发展，我国能源的需求量也越来越大。由于煤炭、石油等不可再生资源日益短缺，人们逐渐把研究开发的热点转移到利用非粮饲料生产纤维乙醇的可再生能源方面。玉米秸秆是一种丰富可再生的资源，而利用玉米秸秆生产乙醇也必然成为发展趋势。目前，秸秆生产乙醇工艺虽然逐步成熟，但是还存在许多问题，主要表现在预处理效率低、纤维素酶活性低、糖化效率低等方面。因此，本文针对玉米秸秆预处理效率低等问题展开研究，旨在筛选出能够高效降解玉米秸秆木质素的菌株，并对其发酵产酶条件进行优化，提高其对木质素的降解效率高效降解木质素，使秸秆中的纤维素和半纤维素成分最大量的释放出来，从而提高纤维素糖化效率，为工业化生产提供优良菌株资源。 本研究从多年玉米秸秆还田的土壤中分离到262株单克隆，利用PDA-愈创木酚平板显色和PDA-苯胺蓝平板褪色的方法，初步筛选到漆酶和过氧化物酶活力较高的5株菌，然后，5株菌进一步酶活测定结果表明：菌株LYADJ-1的产酶能力最强，且同时产生3种木质素酶。根据菌落形态及真菌ITS区基因片段测序分析的结果，菌株LYADJ-1归属于黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium），并将其命名为Phanerochaete chrysosporium LYADJ-1。随后，本研究对这株菌进行紫外诱变，最终筛选到一株酶活高的突变株LYADJ-1-09，此诱变菌株的发酵结果表明：液态发酵的第9天，酶活力最高，为4600U/L，与野生菌株相比，其酶的活力提高了1.5倍。 其次，本研究利用单因素试验和正交试验对诱变菌株LYADJ-1-09液态培养产酶条件进行了优化，得到最优的发酵条件为葡萄糖10g/L，酒石酸铵0.9g/L，吐温-800.1g/L，发酵温度35°C，底物pH值4.5，培养时间6天。在此发酵条件下，Lip活力最高，为6229U/L，与未优化相比，其酶的活力提高了1.35倍。正交试验结果进一步表明：在整个发酵的过程中，葡萄糖含量是影响木质素过氧化物酶酶活最重要的因素，其次是培养温度和初始pH值，而其它因素对酶活的影响较小。 最后，本研究利用优化培养条件下获得的粗酶液进行玉米秸秆木质素降解实验。单因素分析和正交试验的结果表明:最优的降解条件为酶液添加量50mL，酶解温度45°C，底物pH值4.3，降解时间60h，在优化的条件下，木质素的降解率可达29.76%。另外，正交实验结果进一步表明：在酶液对木质素的降解过程中，酶液添加量是影响木质素降解率的最重要因素，其次是初始pH值和降解温度。实验数据为进一步工业化研究提供依据。 【关键词】：玉米秸秆 木质素降解菌 筛选鉴定 诱变 发酵
【学位授予单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要9-11
• ABSTRACT11-13
• 第1章 绪论13-25
• 1.1 玉米秸秆生产纤维乙醇概述13-14
• 1.1.1 玉米秸秆资源的利用13-14
• 1.1.2 玉米秸秆生产纤维乙醇的可行性14
• 1.1.3 玉米秸秆生产纤维乙醇存在的问题14
• 1.2 木质纤维素预处理研究14-16
• 1.2.1 物理预处理15
• 1.2.2 化学预处理15
• 1.2.3 理化预处理15
• 1.2.4 生物预处理15-16
• 1.3 木质素降解菌16-17
• 1.3.1 木质素降解细菌16-17
• 1.3.2 木质素降解真菌17
• 1.4 木质素降解酶17-19
• 1.4.1 木质素过氧化物酶（Lip）18
• 1.4.2 锰依赖过氧化物酶（MnP）18-19
• 1.4.3 漆酶的催化作用19
• 1.5 菌种诱变19-21
• 1.5.1 诱变育种的特点19-20
• 1.5.2 紫外诱变20-21
• 1.6 木质素降解菌产酶条件研究21-23
• 1.6.1 碳源和氮源21-22
• 1.6.2 诱导物和表面活性剂22
• 1.6.3 微量元素22-23
• 1.6.4 其它因素23
• 1.7 研究的目的和意义23-24
• 1.8 研究的主要内容24-25
• 第2章 玉米秸秆木质素降解菌的筛选鉴定25-41
• 2.1 引言25-26
• 2.2 材料与方法26-29
• 2.2.1 常规试剂药品26-27
• 2.2.2 配置试剂27-28
• 2.2.3 主要仪器与设备28
• 2.2.4 实验材料28
• 2.2.5 培养基28-29
• 2.3 实验方法29-33
• 2.3.1 土壤样本的选择29
• 2.3.2 菌株的平板分离29
• 2.3.3 菌株的初筛29-30
• 2.3.4 菌株的复筛30-32
• 2.3.5 菌落的形态观察32
• 2.3.6 菌株的分子生物学鉴定32-33
• 2.4 结果与分析33-40
• 2.4.1 玉米秸秆木质素降解菌的初筛选33-36
• 2.4.2 玉米秸秆木质素降解菌的初复筛36-37
• 2.4.3 菌种鉴定37-40
• 2.5 本章小结40-41
• 第3章 菌株 LYADJ-1 产木质素降解酶的诱变选育41-49
• 3.1 引言41
• 3.2 材料41-42
• 3.2.1 出发菌种41
• 3.2.2 常规试剂药品41
• 3.2.3 配置试剂41
• 3.2.4 仪器与设备41
• 3.2.5 培养基41-42
• 3.3 实验方法42-43
• 3.3.1 菌株活化42
• 3.3.2 孢子悬液制备42
• 3.3.3 紫外诱变处理42
• 3.3.4 稀释涂平板42
• 3.3.5 诱变致死率的计算42-43
• 3.3.6 有益突变株的筛选43
• 3.3.7 诱变前后菌株产酶能力的比较43
• 3.3.8 突变菌株的遗传稳定性实验43
• 3.4 实验结果43-47
• 3.4.1 最佳诱变时间的确定43-44
• 3.4.2 产酶突变株的筛选44-45
• 3.4.3 诱变前后菌株产酶能力的比较45-46
• 3.4.4 突变株的遗传稳定性实验46-47
• 3.5 本章小结47-49
• 第4章 菌株 LYADJ-1-09 产木质素降解酶的条件优化49-61
• 4.1 引言49
• 4.2 实验材料49-50
• 4.2.1 菌种49
• 4.2.2 常规试剂和药品49
• 4.2.3 仪器与设备49
• 4.2.4 培养基49-50
• 4.3 实验方法50-52
• 4.3.1 菌悬液制备50
• 4.3.2 菌株 LYADJ-1-09 生长曲线的测定50
• 4.3.3 Lip 酶活力测定50
• 4.3.4 产酶条件的优化50-52
• 4.4 实验结果52-59
• 4.4.1 菌体生长曲线的测定52
• 4.4.2 单因素实验52-57
• 4.4.3 正交试验57-59
• 4.5 本章小结59-61
• 第5章 木质素降解酶系对玉米秸秆木质素降解效果的研究61-73
• 5.1 引言61-62
• 5.2 材料与方法62-63
• 5.2.1 主要试剂药品62
• 5.2.2 配置试剂62
• 5.2.3 主要仪器与设备62-63
• 5.2.4 实验材料63
• 5.2.5 培养基63
• 5.3 试验方法63-66
• 5.3.1 玉米秸秆木质素降解率的测定63-65
• 5.3.2 酶解条件的优化65-66
• 5.4 结果与分析66-71
• 5.4.1 单因素试验66-69
• 5.4.2 正交试验69-71
• 5.5 本章小结71-73
• 第6章 结论与展望73-75
• 6.1 主要结论73
• 6.2 展望73-75
• 参考文献75-81
• 致谢81-83
• 在学期间主要科研成果83-84
• 一、发表学术论文83
• 二、其它科研成果83-84

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