秸秆降解菌黄绿木霉木聚糖酶基因的克隆及高效表达

【摘要】：木聚糖是半纤维素的主要成分,而半纤维素又是自然界中除了纤维素之外的第二大丰富的资源。木聚糖酶能够降解自然界中大量存在的木聚糖,在造纸、食品、纺织、饲料、能源工业等方面具有重要的应用前景及商业价值,而且不同来源的木聚糖酶其降解特性不同,因此,有必要对不同来源的木聚糖酶进行系统的研究。本研究应用基因工程手段以黄绿木霉为材料克隆未知木聚糖酶基因,构建高产木聚糖酶的工程菌,并对该木聚糖酶的理化性质、酶学特性、动力学常数等参数进行研究。本实验的主要研究结果如下:1.根据Gen Bank上的绿色木霉、里氏木霉和棘孢木霉木聚糖酶基因两端的保守序列信息,利用Primer5.0软件设计出黄绿木霉木聚糖酶基因克隆引物p1、p2,成功的克隆出一条未知的黄绿木霉木聚糖酶基因的编码序列,并提交到NCBI数据库中,命名为TAX1基因,登录号为KM076643,填补了国际空白。2.利用RT-PCR方法,成功的克隆出黄绿木霉木聚糖酶基因的cDNA序列,通过c DNA序列与DNA序列的比对,确定了TAX1基因中含有一个114bp大小的内含子。3.对黄绿木霉木聚糖酶蛋白进行了氨基酸序列的分析,以及蛋白理化性质和信号肽及保守区域的预测,该蛋白编号为:AIG72020.1,推测该蛋白的分子量为24.2044KD,理论等电点为6.82,分子式为C1086H1602N292O339S1,不稳定系数为17.81,是一种稳定的蛋白质。并对其进行了SDS-PAGE分析及活性电泳分析,得到了约24KD大小的蛋白特异条带,确定其最高酶活时间是在第五天。4.构建了TAX1基因在毕赤酵母中的表达载体TAX1-p PIC9K载体,并将重组载体转化到了毕赤酵母GS115菌株中,进行诱导表达时利用了实时荧光定量PCR技术对表达量进行了相对定量分析,经甲醇诱导表达培养基诱导4d时相对表达量达到最高。5.对重组木聚糖酶进行了酶学特性分析,得到该木聚糖的最适反应温度为50℃,其在40℃到60℃温度范围内具有较好的稳定性。最适p H为6.0,该木聚糖酶在p H4.0-6.0之间具有较好的稳定性,证明该木聚糖酶是一种酸性蛋白。最适底物为木聚糖,同时对秸秆也同样具有较好的分解能力。以木聚糖作为底物时,该木聚糖酶的Vmax=44.25mg/ml·min,Km=0.36mg/ml,Kcat=Vmax/E=0.204S-1,Kcat/Km=0.57ml/S·mg。6.对重组毕赤酵母木聚糖酶酶活性进行测定,确定其最适产酶时间为5d,最适p H为6.0。此时,酶活力达到215.28 IU/ml。在同一条件下与出发菌株的木聚糖酶酶活性相比,重组毕赤酵母木聚糖酶酶活性为出发菌株的3.49倍。 【关键词】：黄绿木霉 木聚糖酶 毕赤酵母 表达 酶学特性
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936;Q78
【目录】：

• 摘要9-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 研究目的与意义12-13
• 1.2 木聚糖13-14
• 1.2.1 木聚糖的结构13
• 1.2.2 木聚糖的降解酶系13-14
• 1.3 木聚糖酶14-16
• 1.3.1 木聚糖酶的分类与作用机理14-15
• 1.3.2 木聚糖酶酶学性质15
• 1.3.3 木聚糖酶的分子结构与分子催化机理15
• 1.3.4 木聚糖酶的应用15-16
• 1.4 木聚糖酶基因的克隆与表达16-17
• 1.5 木聚糖酶的国内外研究概况、水平和发展趋势17-18
• 1.6 本研究的技术路线18-19
• 2 材料与方法19-32
• 2.1 试验材料19-21
• 2.1.1 菌株及载体19
• 2.1.2 试剂及酶类19
• 2.1.3 常用试剂及培养基的配制19-21
• 2.2 试验方法21-32
• 2.2.1 黄绿木霉的菌体培养21
• 2.2.2 木聚糖酶基因的克隆21-24
• 2.2.3 基因生物信息学分析24-25
• 2.2.4 表达载体构建及毕赤酵母的转化25-27
• 2.2.5 重组毕赤酵母的诱导表达及实时荧光定量PCR分析27-28
• 2.2.6 重组木聚糖酶的酶学特性分析与动力学参数测定28-31
• 2.2.7 黄绿木霉及重组毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件优化31-32
• 3 结果与分析32-57
• 3.1 木聚糖酶基因的克隆32-36
• 3.1.1 黄绿木霉基因组DNA及RNA的提取32-33
• 3.1.2 黄绿木霉基因组DNA及cDNA序列的木聚糖酶基因的克隆33-34
• 3.1.3 木聚糖酶基因DNA序列及cDNA序列的大肠杆菌转化34-36
• 3.2 基因生物信息学分析36-39
• 3.2.1 木聚糖酶基因DNA序列与cDNA序列分析与比对及提交36-37
• 3.2.2 木聚糖酶蛋白序列结构分析37-39
• 3.3 表达载体的构建及毕赤酵母转化39-42
• 3.3.1 表达载体的构建39-40
• 3.3.2 重组表达载体的毕赤酵母转化40-41
• 3.3.3 毕赤酵母重组子的鉴定及其诱导表现型鉴定41-42
• 3.4 重组毕赤酵母的诱导表达及实时荧光定量PCR分析42-43
• 3.5 重组木聚糖酶的酶学特性分析与动力学常数测定43-52
• 3.5.1 木糖标准曲线的绘制43
• 3.5.2 重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析及其活性电泳43-45
• 3.5.3 重组木聚糖酶蛋白的酶学特性分析45-48
• 3.5.4 不同底物对木聚糖酶酶活性的影响及其酶促动力学分析48-52
• 3.6 黄绿木霉及重组毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件优化52-57
• 3.6.1 培养时间对黄绿木霉及重组毕赤酵母木聚糖酶活性的影响52-53
• 3.6.2 pH对黄绿木霉及重组毕赤酵母木聚糖酶活性的影响53-54
• 3.6.3 黄绿木霉及重组毕赤酵母最优发酵条件的正交试验设计54-57
• 4 讨论57-62
• 4.1 木聚糖酶基因的克隆57-58
• 4.1.1 基因供体的选择57
• 4.1.2 基因表达系统的选择57-58
• 4.1.3 表达载体的选择58
• 4.1.4 基因片段的克隆58
• 4.2 基因生物信息学分析58-59
• 4.2.1 木聚糖酶基因序列分析58-59
• 4.2.2 木聚糖酶蛋白结构分析59
• 4.3 重组毕赤酵母诱导表达量的实时荧光定量PCR分析59-60
• 4.4 毕赤酵母转化子的PCR鉴定60
• 4.5 木聚糖酶酶学特性分析60
• 4.6 黄绿木霉与重组毕赤酵母木聚糖酶酶活性对比60-62
• 5 结论62-63
• 致谢63-64
• 参考文献64-71
• 附录71-76
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文76

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