秸秆发酵制取生化腐殖酸过程中的理化特性及微生物学特性研究

【摘要】：我国的秸秆资源十分丰富,常规方法是将秸秆发酵作为有机肥,利用秸秆发酵制取生化腐殖酸,既可减少环境污染,又可得到高附加值的生化腐殖酸产品,从而提高秸秆资源化利用率。本研究探讨了稻草段+尿素、稻草粉+尿素、稻草段+牛粪、稻草粉+牛粪四种处理在发酵过程中的理化性质、秸秆组分化、腐殖质形成和微生物类群特征,取得了以下结果。 发酵过程中,4种处理的理化性质发生了系列变化。堆料颜色逐渐由黄色或黄棕色转化成棕黑色；发酵最高温度达74℃,高温阶段(≥55℃)持续了25d；发酵料pH呈现出先降低再升高的趋势,发酵结束后物料pH为7.92-8.08。 各处理中温和高温微生物数量细菌放线菌真菌。发酵结束后,中温细菌数量介于1.10×109～1.32×109cfu·g-1,中温放线菌数量介于1.10×106～1.22×106cfu·g-1;中温真菌数量介于4.33×103～5.64×103cfu·g-1之间。各处理的高温细菌数量介于2.99×108～4.6×108cfu·g-1,高温放线菌数量介于7.81×105～8.21×105cfu·g-1。而发酵初期,物料中未能检测到高温真菌；至第30d,各处理高温真菌数量达到最高,介于1.25×104～1.52×104cfu·g-1,至发酵结束(60d),高温真菌数量介于2.47×103～5.00×103cfu·g-1。 不同处理的纤维素、半纤维素和木质素含量随发酵时间延长而降低。其中,纤维素含量由初始值29.61%-31.99%降至1.24～1.96%,半纤维素含量从初期的24.16%～27.74%降至后期的5.97%-6.42%。木质素含量略有减少,由初始的25.28%～25.93%降低至24.76%-25.11%。 水溶性组分含量表现为先增加后降低,由初期4.3%～9.8%增加至17.5%-18.1%,随后降至9.8%-10.9%。发酵料的C/N由初始的31.7～32.8下降至13.9-14.7。腐殖质含量由初始的55.6g·kg-1～81.3g·kg-1增加到117.3g·kg-1～125.8g·kg-1。富里酸含量由初期的38.2g·kg-1～41.3g·kg-1降低至29.9g·kg-1～33.4g·kg-1,而胡敏酸含量由12.7g.kg-1～34.4g·kg-1增加至81.3g·kg-1～85.8g·kg-1,发酵料的H/F由0.31-0.83增加到2.49-2.70。 对4个处理的腐熟期样品细菌群落进行了DGGE-PCR分析,结果表明,处理Ⅰ和Ⅱ的条带数为22,处理Ⅲ和Ⅳ的条带数为20；对DGGE图谱进行多样性指数分析,结果显示,处理Ⅰ和Ⅱ细菌丰度和多样性指数高于处理Ⅲ和Ⅳ。对DGGE条带克隆测序,结果表明,样品中的细菌主要有苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.).假单胞菌属(Pseudomonas sp.).未可培养屈挠杆菌科(UnculturedFlexibacteraceae bacterium),其余为未培养菌(Uncultured bacterium)。这些菌属于γ变形菌门(γ-proteobacteria),α变形菌门(α-proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。 采用454焦磷酸测序对添加尿素和牛粪的两种秸秆发酵样品(处理Ⅰ对应S1；处理Ⅳ对应S2)的细菌类群进行了分析,结果表明,在门、纲、目、科、属的分类水平上,两个样品的细菌群落结构和优势菌群不同。主要集中在变形杆菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes);S1和S2的变形杆菌门类群比例分别为31.62%和35.81%,拟杆菌门比例分别占27.41%和35.29%。此外,S1中厚壁菌门(Firmicutes)占18.15%,unclassified Bacteria占8.80%,柔膜菌门(Tenericutes)占7.28%,其他门占6.74%；而在S2中,厚壁菌门(Firmicutes)占3.43%,unclassified Bacteria数量占9.63%,浮霉菌门(Planctomycetes)占7.06%,其他门的细菌占8.78%。 在属的分类水平,在≥1%比例上,S1中有17个属,S2有13个属。样品S1主要有假单胞菌属(Pseudomonas)、无胆甾原体属(Acholeplasma)、Alkaliflexus、Sulfurimonas、 Petrimonas、Serprns、Tissierella、Sedimentibacter、密螺旋体属(Treponema)、纤维杆菌属(Fibrobacter)、Sphingopyxis、Saccharofermentans、梭菌属(Clostridium)、螺旋体属(Spirochaeta)、脱硫单胞菌属(Desulfuromonas)、Luteimonas、Pusillimonas,S2中主要有Acholeplasma、Alkaliflexus、Sphingopyxis、Devosia、Methylobacillus、Steroidobacter、 Aequorivita、Arenibacter、Rhodopirellula、Vitellibacter、Lysobacter、Crocinitomix、 Blastopirellua。在≥1%比例上,仅Acholeplasma、 Alkaliflexus、Sphingopyxis三个属为两个样品共有的类群。在两处理样品中,top10的OTUs中没有共同的单元,说明发酵料添加牛粪和尿素对细菌类群影响大,导致优势类群完全不同。 本研究结果表明,应用不同外加氮源,秸秆发酵形成生化腐殖酸过程中,尽管发酵温度等参数、秸秆降解率、腐解物中的腐殖质含量及其组分不存在显著差异,但微生物类群显著不同,且添加尿素的秸秆发酵物料细菌类群多样性高于添加牛粪的处理,说明在不同环境中,参与腐殖酸形成与转化的微生物群落呈现多样化。 【关键词】：秸秆发酵 降解率 生化腐殖酸 DGGE 454焦磷酸测序 微生物类群
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S141
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 1 文献综述13-44
• 1.1 前言13-14
• 1.2 秸秆发酵腐解研究进展14-23
• 1.2.1 我国秸秆现状14-16
• 1.2.2 秸秆的成分及结构16-18
• 1.2.3 秸秆发酵腐解过程及其影响因素18-19
• 1.2.4 秸秆发酵腐解工艺19-20
• 1.2.5 秸秆发酵腐解的微生物过程20-21
• 1.2.6 影响秸秆腐解的因素21-23
• 1.2.7 发酵腐解处理存在的问题23
• 1.3 腐殖质研究进展23-35
• 1.3.1 腐殖质形成27-28
• 1.3.2 腐殖质的分离与组分28-30
• 1.3.3 生化腐植酸30-32
• 1.3.4 堆肥发酵过程中腐殖质的变化32-34
• 1.3.5 腐殖酸的应用34-35
• 1.4 秸秆发酵腐解过程中微生物群落结构的研究进展35-42
• 1.4.1 微生物多样性研究方法35-40
• 1.4.1.1 传统的微生物研究方法35-36
• 1.4.1.2 BIOLOG微平板方法36-37
• 1.4.1.3 PLFA图谱分析37-38
• 1.4.1.4 分子生物学方法38-40
• 1.4.2 堆肥发酵过程中微生物类群动态变化研究40-42
• 1.5 本课题研究意义及内容42-44
• 1.5.1 研究意义42-43
• 1.5.2 研究内容43-44
• 2 秸秆发酵生成腐殖酸过程中的理化特性动态变化44-56
• 2.1 材料与方法44-47
• 2.1.1 原料44
• 2.1.2 秸秆好氧发酵处理44
• 2.1.3 好氧发酵操作管理44-45
• 2.1.4 测定项目与方法45-47
• 2.2 结果与分析47-54
• 2.2.1 颜色、气味变化47-48
• 2.2.2 温度变化48-49
• 2.2.3 水分变化49-50
• 2.2.4 pH变化50
• 2.2.5 可培养微生物数量变化50-54
• 2.3 讨论54-56
• 3 秸秆发酵生成腐殖酸过程中的物质转化及腐殖质组分变化56-66
• 3.1 材料与方法56-59
• 3.1.1 实验材料56
• 3.1.2 实验方法56-59
• 3.2 结果与分析59-64
• 3.2.1 纤维素含量变化59
• 3.2.2 半纤维素含量变化59-60
• 3.2.3 木质素含量变化60
• 3.2.4 水溶性组分60-61
• 3.2.5 C/N变化61-62
• 3.2.6 腐殖质含量变化62
• 3.2.7 富里酸含量变化62-63
• 3.2.8 胡敏酸含量变化63
• 3.2.9 H/F变化63-64
• 3.3 讨论64-66
• 4 秸秆发酵生成腐殖酸过程中细菌群落结构的DGGE分析66-80
• 4.1 样品总DNA提取66-67
• 4.1.1 试剂配制66
• 4.1.2 实验材料66
• 4.1.3 样品预处理66-67
• 4.1.4 DNA粗提取67
• 4.1.5 DNA纯化67
• 4.1.6 纯化DNA的检测67
• 4.2 细菌群落PCR-DGGE分析67-73
• 4.2.1 试剂配制68-69
• 4.2.2 实验方法69-73
• 4.3 结果与分析73-78
• 4.3.1 样品总DNA提取及纯化效果73-74
• 4.3.2 16S rDNA V3区扩增74
• 4.3.3 DGGE图谱及多样性分析74-76
• 4.3.4 条带克隆测序分析76-78
• 4.4 讨论78-80
• 5 秸秆发酵生成腐殖酸过程中细菌群落454测序分析80-93
• 5.1 材料与方法80-82
• 5.1.1 实验材料80
• 5.1.2 引物设计80-81
• 5.1.3 样本处理81-82
• 5.1.4 上机测序82
• 5.2 结果与分析82-91
• 5.2.1 数据预处理及有效数据的统计82-83
• 5.2.2 操作分类单元(OTU)分类及Alpha评估83
• 5.2.3 在门(Phylum)分类水平细菌类群变化83-84
• 5.2.4 在纲(Class)分类水平细菌类群变化84-85
• 5.2.5 在目(Order)分类水平细菌类群变化85-86
• 5.2.6 在科(Family)分类水平细菌类群变化86-87
• 5.2.7 在属(Genus)分类水平细菌类群变化87-88
• 5.2.8 系统发育树的构建和属的分类信息88-90
• 5.2.9 样品中top 10的OTUs分析90-91
• 5.3 讨论91-93
• 6 全文结论93-95
• 7 本研究创新之处95-96
• 参考文献96-108
• 致谢108-110
• 攻读博士学位期间发表论文110

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