高寒草地真菌纤维素降解酶系及其对油菜秸秆降解活性的研究

【摘要】：在我国北方尤其是高寒地区,油菜秸秆通常被农牧民用作燃料,造成了资源浪费和环境污染。探索一种构建高效降解油菜秸秆细胞壁物质多酶系菌群的方法,采用微生物发酵技术降解油菜秸秆,对促进油菜秸秆资源循环和再生利用具有十分重要的意义。 论文以项目组前期分离获得的来自东祁连山高寒草地土壤中的真菌菌株作为研究材料,采用底物显色的初步筛选法和酶活力复选法,筛选出产羧甲基纤维素酶、木聚糖酶和漆酶菌株,通过rDNA-ITS基因序列分析、培养特性、液体发酵粗酶液的酶学性质及不同菌株液体发酵粗酶液之间的协同效应分析,构建多酶系菌群,并研究多酶系菌群对油菜秸秆的降解活性,取得了以下主要结果： (1)从125株真菌菌株中筛选得到56个纤维素分解菌株,其中：有49个菌株能在滤纸平板培养基上生长,且不同菌株对滤纸的分解程度不同；筛选出34个既能产羧甲基纤维素酶又能产木聚糖酶的菌株,稳定性测定后,最终获得4株高产羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的菌株,经rDNA-ITS基因序列分析,4个菌株初步鉴定为：阿太菌属(Athelia sp.)(菌株23a)、Saccharicola sp(菌株24d)、埃里砖格孢属(Embellisia sp.)(菌株26B)、梭孢壳属(Thielavia sp.)(菌株H)。在56个菌株中,有9个菌株在-萘酚-PDA培养基和愈创木酚-PDA培养基上都能产生褐色氧化带,其中有6个菌株能在分别以愈创木酚、邻苯二酚、邻苯甲苯胺为底物的选择性培养基上生长,产生褐色氧化带；以愈创木酚为底物测定漆酶活力,结果发现只有菌株310b产生漆酶。经rDNA-ITS基因序列分析,初步鉴定为：小皮伞属(Marasmiussp.)。 (2)对菌株310b产漆酶条件的研究结果表明：菌株310b在25℃、pH=4.0时产漆酶的酶活力最大；9种碳源抑制菌株产漆酶,蛋白胨诱导菌株产漆酶,且酶活力最高；邻甲苯胺、-萘酚和吐温-80等3种非营养有机物促进菌株产漆酶,愈创木酚对菌株产漆酶没有明显的作用；邻苯二酚、单宁酸、吲哚乙酸抑制菌株产漆酶,其中吲哚乙酸抑制作用最强烈；随Cu2-增加,产漆酶活力增加,0.025g/L时产酶活力最大；随着接种量的增加,诱导菌株产漆酶；转速在0～180r min-1范围内,随着转速的增加,漆酶的酶活力增加,且转速达到180r min-1时,酶活力达到最大。 (3)5个菌株生长的最适温度范围在25-35℃之间,25℃条件下菌株两两混合培养7d后,发现5个菌株间可以共存。5个菌株产酶的种类及酶活力大小不同,菌株26B产生的羧甲基纤维素酶活力最高,24d产生的木聚糖酶活最高；将不同菌株的发酵粗酶液两两等体积混合后,与对应的单个菌株的酶活力相比较,反应体系中羧甲基纤维素酶、木聚糖酶和漆酶的酶活力下降,5个菌株间随机组合进行液体发酵后,单个菌株和组合菌株反应体系中的酶活力t测验结果表明,漆酶的酶活力变化差异显著(p0.05),但在菌株26B、310b和24d的不同组合中,羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的酶活力变化差异不显著(p0.05)。 (4)产羧甲基纤维素酶菌株26B在55℃、pH=6时酶的催化活性达到最大值,菌株23a在30℃、pH=5时酶的催化活性达到最大值,菌株H在50℃、pH=5.5时酶的催化活性达到最大值；菌株26B产生羧甲基纤维素酶对热不稳定,菌株23a和H的羧甲基纤维素酶在0-40℃相对稳定。产木聚糖酶菌株24d在55℃、pH=5时酶的催化活性达到最大值。菌株23a在35℃、pH=5.5时酶的催化活性达到最大值,菌株H在55℃、pH=5.0时酶的催化活性达到最大值。菌株24d产生的木聚糖酶对热不稳定,菌株23a和H的木聚糖酶在0-35℃相对稳定。产漆酶菌株310b在30℃、pH=4.5时酶的催化活性达到最大值,且在0-45℃酶活力相对稳定。 (5)将菌株26B、310b和24d等3个菌株组合后进行固体发酵,结果表明,相比于其他组合,固体发酵60d后,反应体系中的相对还原糖含量高,相对纤维素含量低,油菜秸秆颜色变浅、菌丝附着多,扫描电镜结果显示,与对照相比,秸秆表面、断裂处、秸秆髓部等都发生了明显的变化。菌株310b、24d和26B组合的多酶系菌群对油菜秸秆的降解效果明显。 【关键词】：高寒草地 纤维素降解酶系 油菜秸秆 细胞壁物质 降解活性
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X172;X712
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 文献综述11-26
• 1 纤维素类物质资源及研究降解纤维素类物质真菌的意义11-12
• 1.1 纤维素类物质资源11
• 1.2 研究降解纤维素类物质真菌的意义11-12
• 2 降解纤维素类物质真菌的研究方法12-16
• 2.1 分离方法12
• 2.2 筛选方法12-16
• 2.2.1 初步筛选12-13
• 2.2.2 复选13-16
• 2.2.2.1 酶活力筛选法13
• 2.2.2.2 合菌群筛选法13-14
• 2.2.2.3 诱变选育法14-15
• 2.2.2.4 基因筛选法15-16
• 2.3 降解纤维素类物质真菌DNA多态性分析16
• 3 高寒草地降解纤维素类物质微生物生态过程和功能的研究16-21
• 3.1 我国草地微生物生态的研究概况17
• 3.2 微生物功能群的界定及降解纤维素类物质微生物的生态学研究17-19
• 3.2.1 微生物功能群的界定17-18
• 3.2.2 高寒草地降解纤维素类物质微生物的生态学研究18-19
• 3.3 降解纤维素类物质微生物的生态过程19-20
• 3.4 高寒草地降解纤维素类物质微生物多样性与生态系统功能20
• 3.5 存在的问题20-21
• 4 高寒地区油菜秸秆资源及再生利用的意义21-24
• 4.1 油菜秸秆资源21
• 4.2 油菜秸秆资源的利用状况21-23
• 4.3 高寒地区油菜秸秆资源再生利用的意义23-24
• 5 论文的研究意义、研究内容和技术路线24-26
• 5.1 研究意义24
• 5.2 研究内容24-25
• 5.3 技术路线25-26
• 第二章 纤维素分解真菌和产纤维素酶菌株的筛选及分子鉴定26-38
• 1 材料与方法27-30
• 1.1 供试菌株及来源27
• 1.2 培养基27-28
• 1.3 研究方法28-30
• 1.3.1 初步筛选28
• 1.3.1.1 羧甲基纤维素钠平板培养基筛选法28
• 1.3.1.2 滤纸平板培养基筛选法28
• 1.3.1.3 滤纸分解度实验28
• 1.3.2 产酶菌株复选28-30
• 1.3.2.1 绘制标准曲线28-29
• 1.3.2.2 粗酶液的制备29
• 1.3.2.3 酶活力测定29-30
• 1.3.3 纤维素分解真菌菌株的稳定性测定30
• 1.3.4 rDNA-ITS鉴定30
• 2 结果与分析30-35
• 2.1 初步筛选结果30-32
• 2.2 复选结果32
• 2.3 菌株的稳定性及酶活力测定结果32-33
• 2.4 分子鉴定结果33-35
• 3 讨论35-37
• 4 小结37-38
• 第三章 产漆酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件的初步研究38-47
• 1 材料与方法39-40
• 1.1 供试菌株39
• 1.2 培养基39-40
• 1.3 研究方法40
• 1.3.1 初步筛选40
• 1.3.2 粗酶液的制备及漆酶活力测定40
• 1.3.3 rDNA-ITS鉴定40
• 1.3.4 产酶条件的研究40
• 1.4 数据处理及分析40
• 2 结果与分析40-45
• 2.1 初步筛选结果40-41
• 2.2 复选结果41
• 2.3 分子鉴定结果41-42
• 2.4 产漆酶条件的研究结果42-45
• 2.4.1 温度对菌株310b产漆酶的影响42
• 2.4.2 初始pH值对菌株310b产漆酶的影响42
• 2.4.3 C源对菌株310b产漆酶的影响42-43
• 2.4.4 N源对菌株310b产漆酶的影响43
• 2.4.5 非营养有机物对菌株310b产漆酶的影响43
• 2.4.6 Cu~(2+)对菌株310b产漆酶的影响43
• 2.4.7 接种量对菌株310b产漆酶的影响43
• 2.4.8 转速对菌株310b产漆酶的影响43-45
• 3 讨论45
• 4 小结45-47
• 第四章 高产酶活菌株的培养特性47-54
• 1 材料与方法47-48
• 1.1 供试菌株47
• 1.2 培养基47-48
• 1.3 研究方法48
• 1.3.1 培养特性48
• 1.3.2 菌株间相互关系48
• 1.4 数据处理及分析48
• 2 结果与分析48-51
• 2.1 温度对菌株生长的影响48-49
• 2.2 不同碳源对菌株生长的影响49-50
• 2.3 不同氮源对真菌生长的影响50-51
• 2.4 菌株间的相互关系51
• 3 讨论51-53
• 4 小结53-54
• 第五章 高产酶活菌株的酶学性质54-62
• 1 材料与方法54-55
• 1.1 供试菌株54-55
• 1.2 研究方法55
• 1.2.1 酶活力测定55
• 1.2.2 粗酶液酶学性质55
• 2 结果与分析55-60
• 2.1 菌株产酶种类及相对酶活力大小比较55-56
• 2.2 不同菌株发酵粗酶液的酶学性质56-60
• 2.2.1 产羧甲基纤维素酶的酶学性质56-58
• 2.2.2 产木聚糖酶的酶学性质58-59
• 2.2.3 产漆酶的酶学性质59-60
• 3 讨论60-61
• 4 小结61-62
• 第六章 5株菌株不同酶系间协同作用62-69
• 1 材料与方法62-63
• 1.1 供试菌株62
• 1.2 研究方法62-63
• 1.2.1 不同菌株发酵粗酶液等体积混合酶活力测定62
• 1.2.2 不同菌株组合液体发酵产酶分析62-63
• 2 结果与分析63-67
• 2.1 不同菌株粗酶液混合酶活力的变化63-64
• 2.2 菌株组合液体发酵酶活力的变化64-65
• 2.3 菌株组合液体发酵不同酶系间协同作用分析65-67
• 3 讨论67-68
• 4 小结68-69
• 第七章 多酶系菌群对油菜秸秆降解活性的研究69-79
• 1 材料与方法69-71
• 1.1 供试菌株69-70
• 1.2 固体发酵培养基70
• 1.3 研究方法70-71
• 1.3.1 多酶系菌群组合设计70
• 1.3.2 油菜秸秆降解活性研究70-71
• 2 结果与分析71-76
• 2.1 固体发酵粗酶液酶活力的变化71-72
• 2.2 不同组合固体发酵体系还原糖含量的变化72
• 2.3 多酶系菌群降解油菜秸秆细胞壁物质效果72-74
• 2.3.1 油菜秸秆降解的感官评价72-73
• 2.3.2 油菜秸秆纤维素含量的测定结果73-74
• 2.4 粗酶液酶活力与降解活性之间的相关性分析74-75
• 2.5 多酶系菌群对秸秆表面降解的扫描电镜分析75-76
• 3 讨论76-78
• 4 小结78-79
• 第八章 主要结论与研究展望79-81
• 1.1 主要结论79
• 1.2 创新点79
• 1.3 存在问题79-80
• 1.4 研究展望80-81
• 参考文献81-95
• 导师简介95-96
• 个人简介96-97
• 致谢97

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