稻草秸秆降解中生物表面活性剂的增效作用及发酵新工艺

【摘要】： 能源危机的出现使利用木质纤维素类物质生产燃料酒精成为目前国内外研究的热点。鉴于木质纤维素结构的高度复杂性以及纤维素酶的难回收性,将木质纤维素水解成还原糖成为生产燃料酒精的限速步骤。本文即围绕这一限速水解步骤展开研究,旨在最大限度地提高还原糖产量。针对上海地区特殊的农作物种植结构,本文选择稻草秸秆为目标降解物,利用微生物水解稻草秸秆生成还原糖,为后续的燃料酒精生产提供前提条件。 通过纤维素刚果红平板初筛以及测定酶活值复筛,从菜地、腐烂的树根及朽木周围的土壤中筛选出了一株高效稻草降解真菌ZM-4。以ZM-4为出发菌株,通过紫外-硫酸二乙酯复合交替诱变得到高效突变株—里氏木霉ZM4-F3。利用里氏木霉ZM4-F3降解稻草秸秆,发现其所产纤维素酶酶活、产还原糖量、稻草降解率以及纤维素降解率均比出发菌株ZM-4有显著提高。经6代连续培养,ZM4-F3仍能保持较高及较稳定的纤维素酶活性,适用于工业生产。 利用氢氧化钠对稻草秸秆进行预处理,探讨了预处理的最优条件,并利用扫描电镜观察了稻草秸秆预处理前后的形貌。通过三因素四水平的正交实验,优化出里氏木霉ZM4-F3水解稻草秸秆的最佳条件,并利用气相色谱对稻草秸秆水解后的还原糖组成成分进行了详细分析。 鉴于表面活性剂可对纤维素水解起增效作用,本文经蓝色凝胶平板初筛及测定表面张力值复筛,从长期被汽油污染的土壤中筛选出了一株生物表面活性剂产生菌BSZ-07。经生理生化鉴定、扫描电镜分析以及16SrDNA序列分析,初步确定其为铜绿假单胞菌。通过四因素三水平的正交实验,优化出BSZ-07的最优产剂条件。研究发现,BSZ-07能在较长时间内使发酵液保持较好的乳化稳定性,因此是一株较优良的生物表面活性剂产生菌。经傅立叶红外光谱分析、核磁共振分析及元素分析,初步确定BSZ-07所产生物表面活性剂为鼠李糖脂。 向稻草降解体系中添加鼠李糖脂生物表面活性剂以提高其酶解产糖量,并实现了鼠李糖脂的在线生产添加方式。由于在线生产添加方式省去了鼠李糖脂的提纯这一复杂工艺,因而可有效降低鼠李糖脂的生产成本。鼠李糖脂的在线添加通过里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07的两阶段共水解新工艺实现。探讨了两阶段共水解新工艺的最优工艺条件,结果表明,两阶段共水解样品不仅能提高产糖量及稻草降解率,还能有效缩短达最大产糖量及最大稻草降解率的时间。 最后,初步探讨了鼠李糖脂生物表面活性剂对稻草秸秆降解起增效作用的机制。研究结果表明,添加鼠李糖脂后β-葡萄糖苷酶活性的增加、Cel7A酶稳定性的提高、底物表面电荷密度的增大以及鼠李糖脂在木质素表面的吸附可能是其对稻草秸秆降解过程产生增效作用的主要机制。 【关键词】：稻草秸秆 水解 里氏木霉 鼠李糖脂 在线生产
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：X712
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-18
• 第1章 绪论18-41
• 1.1 生物燃料酒精研究现状18-21
• 1.1.1 生物质能研究概况18-19
• 1.1.2 燃料酒精研究概况19-20
• 1.1.3 木质纤维素原料生产燃料酒精的主要步骤20-21
• 1.2 秸秆类纤维素生物降解的研究进展21-31
• 1.2.1 秸秆类纤维素的利用方式21-22
• 1.2.2 稻草秸秆的结构22-23
• 1.2.3 稻草秸秆的预处理方式23-24
• 1.2.4 高效纤维素降解菌的选育24-28
• 1.2.5 纤维素酶的研究进展28-31
• 1.3 生物表面活性剂的研究进展31-38
• 1.3.1 表面活性剂的分类31
• 1.3.2 生物表面活性剂的种类及特点31-33
• 1.3.3 生物表面活性剂产生菌的选育33-34
• 1.3.4 影响生物表面活性剂生产的因素34-35
• 1.3.5 生物表面活性剂的提取方法35
• 1.3.6 生物表面活性剂的应用及发展前景35-37
• 1.3.7 表面活性剂对纤维素生物降解过程的影响37
• 1.3.8 表面活性剂对木质纤维素生物降解产生影响的机理研究37-38
• 1.4 课题研究目的、意义及主要内容38-41
• 1.4.1 研究目的及研究意义38-39
• 1.4.2 研究内容39-41
• 第2章 实验材料、方法与设计41-55
• 2.1 实验材料41-44
• 2.1.1 实验仪器41-42
• 2.1.2 实验试剂42
• 2.1.3 实验用培养基42-43
• 2.1.4 稻草原料及菌种来源43-44
• 2.2 实验方法44-48
• 2.2.1 稻草降解菌的筛选方法44
• 2.2.2 稻草降解菌的诱变方法44-45
• 2.2.3 生物表面活性剂产生菌的筛选方法45-46
• 2.2.4 菌种鉴定方法46-47
• 2.2.5 生物表面活性剂的提取及结构分析方法47-48
• 2.3 实验分析项目及分析方法48-51
• 2.3.1 微生物形态观察法48
• 2.3.2 细胞生长情况测定48-49
• 2.3.3 纤维素酶酶活测定方法49
• 2.3.4 气相色谱分析稻草秸秆水解液中还原糖组成49-50
• 2.3.5 Cel7A 酶的稳定性分析50
• 2.3.6 其它各指标分析方法50-51
• 2.4 实验设计51-55
• 2.4.1 稻草秸秆的预处理条件优化实验51-52
• 2.4.2 稻草降解菌降解稻草秸秆实验52
• 2.4.3 正交实验优化稻草秸秆的水解条件52
• 2.4.4 生物表面活性剂产生菌产生物表面活性剂实验52-53
• 2.4.5 正交实验优化生物表面活性剂产剂性能53
• 2.4.6 两阶段共水解新工艺实验设计53-55
• 第3章 稻草降解菌的筛选及诱变选育55-74
• 3.1 稻草降解菌的筛选55-56
• 3.1.1 初筛结果55-56
• 3.1.2 复筛结果56
• 3.2 ZM-4 的鉴定56-57
• 3.3 ZM-4 降解稻草秸秆最优水解条件的研究57-63
• 3.3.1 最优碳源的确定57-58
• 3.3.2 最优氮源的确定58-60
• 3.3.3 最优温度的确定60-61
• 3.3.4 最优初始pH 值的确定61-63
• 3.4 ZM-4 的生长及产还原糖情况63-65
• 3.4.1 ZM-4 的生长曲线63-64
• 3.4.2 培养时间对ZM-4 产糖情况的影响64-65
• 3.5 稻草降解菌的诱变选育65-69
• 3.5.1 紫外线最佳照射时间的选择65
• 3.5.2 硫酸二乙酯（DES）最佳处理时间的选择65-67
• 3.5.3 高效稻草降解菌突变株的初筛67-68
• 3.5.4 高效稻草降解菌突变株的复筛68-69
• 3.6 ZM4-F3 产纤维素酶酶系组成分析69
• 3.7 ZM4-F3 与ZM-4 降解稻草对照实验69-72
• 3.7.1 ZM4-F3 与ZM-4 产还原糖量对比69-70
• 3.7.2 ZM4-F3 与ZM-4 的纤维素降解率对比70-71
• 3.7.3 ZM4-F3 与ZM-4 的稻草降解率对比71-72
• 3.8 ZM4-F3 产酶稳定性分析72
• 3.9 本章小结72-74
• 第4章 诱变株里氏木霉ZM4-F3 降解稻草的研究74-88
• 4.1 稻草秸秆碱法预处理条件的优化74-77
• 4.1.1 氢氧化钠浓度的选择74-75
• 4.1.2 预处理温度的选择75-76
• 4.1.3 预处理时间的选择76-77
• 4.2 预处理前后稻草秸秆的成分及形貌变化77-79
• 4.2.1 预处理前后稻草秸秆化学成分的比较77-78
• 4.2.2 预处理前后稻草秸秆的形貌分析78-79
• 4.3 正交实验优化ZM4-F3 水解稻草秸秆的条件79-81
• 4.4 气相色谱测定稻草秸秆水解产物中还原糖组分81-84
• 4.4.1 葡萄糖及木糖标准曲线的绘制81-82
• 4.4.2 稻草秸秆水解产物中还原糖组分分析82-84
• 4.5 最优条件下稻草秸秆水解后的滤纸酶活及降解率84-85
• 4.5.1 最优条件下稻草秸秆水解后的滤纸酶活84
• 4.5.2 最优条件下稻草秸秆水解后的降解率84-85
• 4.6 稻草秸秆降解前后的形貌分析85-86
• 4.7 本章小结86-88
• 第5章 生物表面活性剂产生菌的筛选及其产剂性能研究88-104
• 5.1 生物表面活性剂产生菌的筛选88-90
• 5.1.1 初筛88-89
• 5.1.2 复筛89-90
• 5.2 BSZ-07 的鉴定90-94
• 5.2.1 生理生化鉴定90-91
• 5.2.2 扫描电镜（SEM）鉴定91
• 5.2.3 16SrDNA 鉴定91-94
• 5.2.4 鉴定结果94
• 5.3 铜绿假单胞菌BSZ-07 最优产剂条件的研究94-95
• 5.4 BSZ-07 的生长及产剂性能95-97
• 5.4.1 BSZ-07 的生长曲线95-96
• 5.4.2 BSZ-07 发酵液的表面张力96
• 5.4.3 BSZ-07 发酵液的乳化稳定性96-97
• 5.5 生物表面活性剂的提取及结构分析97-101
• 5.5.1 生物表面活性剂的提取97-98
• 5.5.2 生物表面活性剂的FTIR 分析98
• 5.5.3 生物表面活性剂的NMR 分析98-101
• 5.5.4 生物表面活性剂的元素分析101
• 5.6 鼠李糖脂的生产101-102
• 5.7 本章小结102-104
• 第6章 鼠李糖脂的在线生产添加对稻草秸秆降解的增效作用及机制探讨104-117
• 6.1 鼠李糖脂在线生产添加的最优条件104-107
• 6.1.1 最优温度的选择105
• 6.1.2 最优pH 值的选择105-106
• 6.1.3 最优接种量比例的选择106-107
• 6.2 两阶段共水解新工艺的产糖量及稻草降解率分析107-109
• 6.2.1 两阶段共水解新工艺的还原糖产量107-108
• 6.2.2 两阶段共水解新工艺的稻草降解率108-109
• 6.3 不同种类的表面活性剂对稻草秸秆降解增效的影响比较109-110
• 6.4 鼠李糖脂对稻草秸秆降解增效的机制探讨110-115
• 6.4.1 鼠李糖脂对纤维素酶酶系的影响110-111
• 6.4.2 鼠李糖脂对 Cel7A 酶稳定性的影响111-112
• 6.4.3 鼠李糖脂对纤维素及菌体表面电荷密度的影响112-114
• 6.4.4 鼠李糖脂对不同木质素含量的木质纤维素水解的影响114-115
• 6.5 本章小结115-117
• 结论117-120
• 参考文献120-131
• 攻读学位期间发表的学术论文131-132
• 申请专利情况132-134
• 致谢134-135
• 个人简历135

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