共存于厌氧真菌分离培养液中瘤胃甲烷菌的检测及其多样性分析

【摘要】：正反刍动物瘤胃内栖息着各种微生物,包括瘤胃细菌、原虫、厌氧真菌和甲烷菌。这些微生物互相作用、互相影响,在瘤胃内形成一个复杂的降解饲料、给宿主动物提供挥发性脂肪酸和微生物蛋白的生物群落。甲烷是瘤胃微生物代谢的终产物之一,它的产生是能量的损失,也是温室气体之一,因此瘤胃产甲烷菌的研究越来越受到重视。但是,瘤胃内产甲烷菌不能利用复杂的有机物作为能量来源,只能利用瘤胃细菌、原虫、厌氧真菌降解有机物产生的H2、CO2、甲酸等生成甲烷。目前,关于厌氧真菌与瘤胃甲烷菌的研究很少,现有的研究仅局限于单一厌氧真菌与单一产甲烷菌的共培养,而与厌氧真菌共存的瘤胃产甲烷菌的种类及其多样性研究则鲜有报道。此外,在瘤胃厌氧真菌分离培养过程中,常使用抗生素如青霉素、链霉素抑制瘤胃细菌的生长,可达到富集培养的目的,而瘤胃甲烷菌由于其特殊的细胞壁结构,对青霉素、链霉素不敏感,并且能利用真菌的发酵产物如H2、CO2、甲酸等产生甲烷。在目前研究现状的基础上,本研究先通过传统分离培养方法利用厌氧真菌培养基和青霉素、链霉素从山羊瘤胃获得瘤胃厌氧真菌和产甲烷菌菌群混合物,该混合物每3～4d传代1次,选择用于分离该混合菌群的瘤胃液及第5、15、25、35、45、55、62代培养液为材料,抽提总DNA,利用古菌通用引物对16S rRNA进行PCR扩增,扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)分析古菌在传代过程中多样性的变化, 并利用软件分析各样品DGGE图谱的相似性。同时对样品中古菌16S rDNA进行克隆,并利用四种限制性内切酶Taq Ⅰ、Xho Ⅰ、Hin dⅢ、Hin f Ⅰ对所得69个克隆进行酶切多态性分析(RFLP),根据RFLP 分析结果对具有代表性的克隆序列进行测序及系统进化分析。DGGE结果显示,从厌氧真菌分离至第 45代,甲烷菌多样性指数由1．32降至0．99,相似性最低为34．7％;第45代至62代,多样性指数由0．99 升至1．15,相似性最低为89．2％。RLP多态性分析69个克隆共得到5个操作分类单元,选择其中6 个具有代表性的序列进行测序。序列及系统进化分析表明,属于其中3个操作分类单元的克隆最相似菌都是Uncultured arehaeal symbiont PA202,相似性均为95％,没有与这些克隆相似性较高的已培养甲烷菌:属于另外2个操作分类单元的克隆最相似菌都是Uncultured lumen methanogen 956,相似性均为97％, 最相似已知菌为Methanobrevibacter sp．NT7,相似性为97％。上述结果说明,该培养液中存在目前尚未分离培养的瘤胃甲烷菌。 【作者单位】：南京农业大学消化道微生物研究室 南京农业大学消化道微生物研究室 南京农业大学消化道微生物研究室 浙江大学动物科学学院 南京农业大学消化道微生物研究室
【关键词】：厌氧真菌 甲烷菌 DGGE RFLP
【分类号】：S852.6
【正文快照】： 反当动物瘤胃内栖息着各种微生物，包括瘤胃细菌、原虫、厌氧真菌和甲烷菌。这些微生物互相作 用、互相影响，在瘤胃内形成一个复杂的降解饲料、给宿主动物提供挥发性脂肪酸和微生物蛋白的生物 群落。甲烷是瘤胃微生物代谢的终产物之一，它的产生是能量的损失，也是温室气体

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