卤代甲烷—甲基转移酶基因的克隆和功能研究

【摘要】： 自从发现氯氟烃对平流层的臭氧有破坏作用以来,人们对挥发性卤代烃(Volatileh alohydrocarbon,VHC)的天然来源及其产生机制产生了广泛兴趣。CH_3Cl和CH_3Br作为VHC是把Cl和Br带到同温层破坏臭氧的主要形式。同时,由于CH_3Br具有高效性、穿透性强、快速、杀虫谱广等优点,它曾是全球广泛应用的一种熏蒸杀虫剂。但是由于CH_3Br可以破坏臭氧层,以及它产生的溴离子残留可以影响环境等缺点,所以,CH_3Br的使用受到国际协议的约束。 这些CH_3X(X=Cl,Br,I)除了具有生态和环境方面的重要意义外,其天然源泉和生物产生机制也有重要的研究价值。除了CH_3Br熏蒸剂,这些卤代甲烷的重要来源包括:海洋、生物体的燃烧、热带植物、盐沼地、某些作物和真菌等。真菌和藻类除了产生卤代甲烷(CH_3X)外也产生多卤甲烷,而高等植物只产生卤代甲烷(CH_3X)。卤代甲烷是生物合成中一种甲基转移酶发生酶促反应产生的,反应式为:SAM + X-(Cl-,Br-,or I-)→CH_3X + S-adenosylhomocysteine。Saini等通过检测118种高等植物CH_3I的释放来确定哪些植物具有甲基转移酶活性,他们发现至少有87种植物具有卤化物甲基转移酶的活性,由此推测出卤代甲烷—甲基转移酶普遍存在于高等植物中。他们同时指出,通过基因工程,有可能实现把这种酶的基因转化到对Cl-敏感的作物品种里来提高植物的抗盐性。模式生物拟南芥也产生和释放卤代甲烷,而行使此功能的主要的酶是由HOL(HARMLESS TO OZONE LAYER)基因编码的,该酶属于甲基转移酶家族,能催化依赖SAM的Cl-、Br-、I-的甲基化,对该基因的系统发生学分析表明在维管植物中广泛存在着产生卤代甲烷的能力。 在引起植物侵染性病害的四大病原中,植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒,仅次于真菌病害。根结线虫是一种分布范围广,严重危害农作物的植物内寄生线虫。对各种农作物根结线虫防治的方法有:药物(如甲基溴)防治、生物制剂(如线虫生防细菌)防治等,世界上已经有许多国家如:美国,英国、印度、墨西哥等国家开始使用植物防治线虫,并取得了较好的结果。 本实验把克隆到的三种植物的卤代甲烷-甲基转移酶基因:拟南芥的HOL(ATMCT)及其在盐芥、碱篷中的同缘基因THMCT、SSMCT进行研究:构建了三种基因过量表达载体(MCThis-pCAMBIA3301),用花侵染法转化拟南芥,通过比较转基因拟南芥植株释放卤代甲烷的能力比较三种蛋白的活性。由于在测定卤代甲烷释放的和纯化植物蛋白有一定难度,该实验仍在进行中。 本论文构建了转化烟草、大豆、草莓和百脉根用的三种基因载体MCThis-pINT4,提供给本实验室的同事进行研究。目的是实现烟草在不受Cl-胁迫下施用经济实惠的KCl提高烟草的钾离子含量,改良转基因烟草的品质;提高大豆、草莓等对Cl-敏感的作物的耐氯性;同时实现植物自身释放的CH_3Br能够抑制植物线虫病害,减少外源化学药品的使用。 构建了三种基因细胞内定位载体MCT-GFP-pCAMBIA3301,通过花侵染法转化拟南芥,用激光扫描共聚焦显微镜观察发现三种卤代甲烷—甲基转移酶都定位在细胞质中。 构建了三种载体MCT-p195转化酵母,使转基因酵母成为对线虫有一定抑制作用的工程菌。目前,对线虫抑制实验正在进行中。 构建了拟南芥HOL基因(at2g43910)启动子定位载体HOL-promoter-GUS转化拟南芥,组织化学染色显示其主要在植物幼叶、叶腋芽、雌蕊、花冠、表皮毛、排水器、输导组织和根中表达。 把三种基因在原核细胞中表达,发现ATMCT和同源性很高的THMCT大部分以可溶性蛋白形式存在于裂解细胞的上清中,而碱篷的SSMCT则以包涵体的形式存在沉淀中。 用Ni-组氨酸吸附琼脂糖珠亲和层析法纯化原核表达的ATMCT蛋白,通过洗涤包涵体的方式获得较纯的SSMCT蛋白,两种蛋白分别作为抗原免疫新西兰种兔制作了相应抗体。Western杂交显示,制备的两种抗体的效价和纯度都很高。由于ATMCT和SSMCT同源性较高,两种抗体与ATMCT、THMCT和SSMCT杂交都有信号。 本论文对三种卤代甲烷—甲基转移酶基因的研究只是处在初级阶段,今后的工作任务会在测定并比较三种酶的活性等方面进一步研究。 【关键词】：卤代甲烷—甲基转移酶 卤代甲烷(CH_3X) 甲基氯(CH_3Cl) 甲基溴(CH_3Br) 原核表达
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：Q78
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 英文缩略表9-10
• 第一部分 文献综述10-19
• 一、卤代甲烷（CH3X）与环境10
• 二、卤代甲烷（CH3X）的自然源研究10-11
• 三、卤代甲烷的产生机制研究进展11-13
• 四、模式植物拟南芥的HOL 基因13-14
• 五、植物产生卤代甲烷的生理作用和进化意义14-16
• 六、甜土植物和盐生植物16
• 七、Cl~-的均衡16-17
• 八、线虫17-19
• 第二部分 实验论文19-46
• 一、实验材料和方法19-34
• 1. 实验材料19-22
• 2. 主要仪器设备22
• 3. 用到的软件22
• 4.P CR 引物22-23
• 5. 基本实验方法23-26
• 6. 突变体纯合子的鉴定26-28
• 7. 植物过量表达载体的构建及转化28-29
• 8. 原核蛋白的表达及纯化29-30
• 9.W estern 杂交30-32
• 10. 拟南芥MCT（HOL）的组织定位32
• 11.M CT 蛋白的亚细胞定位32-33
• 12.M CT 基因转化酵母研究33-34
• 二、实验结果与分析34-44
• 1. MCT 基因的克隆及序列分析34-36
• 2. 突变体的PCR 鉴定36-37
• 3. ATMCT、THMCT 和SSMCT 基因植物表达载体的构建及验证37
• 4. ATMCT、THMCT 和SSMCT 基因的原核表达37-39
• 5. Western 杂交39-40
• 6. 拟南芥HOL 基因启动子的组织定位40-41
• 7. MCT 蛋白的亚细胞定位41-42
• 8. MCT 基因转化酵母42-44
• 三、讨论44-46
• 图版46-49
• 参考文献49-54
• 攻读硕士学位期间发表的论文54-55
• 致谢55

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