詹氏甲烷球菌NifH1和酿酒酵母Ndl1的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析

【摘要】：1固氮作用是由固氮菌中的固氮复合物完成的。固氮复合物由固氮酶和固氮还原酶组成,其中固氮酶是一个由NifD和NifK蛋白组成的α2β2异四聚体,固氮还原酶是一个由NifH蛋白组成的同二聚体。目前,已经在没有固氮作用的嗜热产烷生物詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)中发现了固氮酶NifD/K和NifH同源物的表达(命名为NflD/K和NlfH,Nfl=Nif-like,M. jannaschii中的NlfH在这里被称作Mj.NifH1),但是其功能还不清楚。解出Mj.NifH1的晶体结构将对我们理解其功能以及了解其在进化上的作用提供很大的帮助。 在本课题中,我们构建了Mj.NifH1的表达载体,并通过镍柱亲和和HiLoad 16/60 Superdex 200 size-exclusion column凝胶层析等方法得到了纯化后的目的蛋白。目的蛋白通过悬滴气相扩散法在287K进行晶体生长,并得到可以进行X射线衍射和数据收集的蛋白晶体。在上海同步辐射加速器收集到一套最高分辨率为3.3 ?的衍射数据。晶体的空间群是P4132,晶胞参数为a = b = c =139.45 ?,确定每个不对称单位含有一个蛋白分子。 2动力蛋白(Dynein)是一种细胞中的马达蛋白,可以将包含ATP在内的化学能转换为运动过程中的机械能,在有丝分裂、膜转运和胞内运输中起着关键作用。动力蛋白作用的发挥需要许多蛋白的共同协调作用,如NUDEL家族中的一员Ndl1,对于动力蛋白正常地定位到动粒上非常关键。Ndl1可以激活动力蛋白调节的蛋白转运,而当它结合到分裂激素和动力蛋白时,可以稳定动力蛋白或动力蛋白激活蛋白,使其不会进行微管依赖的脱落过程,从而进一步产生分子马达的作用。Ndl1缺失时会导致结合到微管正极的动力蛋白减少,从而影响有丝分裂等过程。 在本课题中,为获得酿酒酵母中Ndl1蛋白(Sc.Ndl1)的晶体结构,为进一步了解其发挥功能的分子机制提供线索,我们构建了Sc.Ndl1的表达载体,并表达、纯化得到目的蛋白,并进行晶体生长。目前得到一颗Sc.Ndl1蛋白晶体,晶体优化正在进行中。 【关键词】：固氮酶 NifH 詹氏甲烷球菌 有丝分裂 动力蛋白 Ndl1 酿酒酵母
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：TS261.1
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一篇 詹氏甲烷球菌 NifH1 的初步晶体学研究10-47
• 第一章 研究背景概述10-24
• 1.1 固氮作用10-12
• 1.1.1 氮的重要作用以及氮循环10-12
• 1.1.2 固氮的形式及意义12
• 1.2 固氮酶系统12-15
• 1.3 固氮机制15-16
• 1.4 固氮酶同源物16-20
• 1.5 詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）中NifH 蛋白的研究进展20-24
• 1.5.1 詹氏甲烷球菌简介20
• 1.5.2 Mj.NifH1 和Mj.NifD 在体内的表达情况20-21
• 1.5.3 Mj.NifH1 和Mj.NifH2 的介绍及对比21-22
• 1.5.4 Mj.NifH 和Mj.NifD 在进化上的重要意义22-23
• 1.5.5 Mj.NifH 结构生物学的研究意义及进展23-24
• 第二章 实验材料与方法24-32
• 2.1 质粒构建24-26
• 2.1.1 引物设计24
• 2.1.2 PCR 进行目的基因片段的扩增24-25
• 2.1.3 PCR 产物的回收、酶切以及连接到载体25
• 2.1.4 将连接产物转化到E.coli TOP10 菌株中25
• 2.1.5 质粒的抽提与鉴定25-26
• 2.1.6 PCR 和双酶切鉴定质粒26
• 2.2 目的蛋白的表达纯化26-30
• 2.2.1 先用5ml 的LB 小管小量培养以摸索表达条件27
• 2.2.2 扩大培养27
• 2.2.3 蛋白纯化27-30
• 2.3 晶体的筛选和优化30-31
• 2.3.1 蛋白质晶体生长原理30
• 2.3.2 晶体初筛30-31
• 2.3.3 晶体优化31
• 2.4 晶体X 射线衍射数据的收集和处理31-32
• 2.4.1 衍射数据收集31
• 2.4.2 结构解析31-32
• 第三章 实验结果与讨论32-42
• 3.1 Mj.NifH1 全长基因的克隆和质粒构建32
• 3.2 Mj.NifH1 的表达纯化32-34
• 3.2.1 小量表达以摸索表达条件的结果32
• 3.2.2 镍柱纯化的结果32-33
• 3.2.3 液相色谱层析的结果33-34
• 3.3 Mj.NifH1 的晶体生长34-36
• 3.3.1 Mj.NifH1 的晶体生长浓度条件摸索34-35
• 3.3.2 Mj.NifH1 的晶体初筛35
• 3.3.3 Mj.NifH1 的晶体优化35-36
• 3.4 Mj.NifH1 晶体结构的解析工作36-37
• 3.4.1 衍射数据收集36-37
• 3.4.2 晶体结构解析37
• 3.5 Mj.NifH1 蛋白性质分析37-42
• 3.5.1 动态光散射检测蛋白聚集状态37-38
• 3.5.2 原子吸收光谱检测Fe 元素38-42
• 小结42-43
• 参考文献43-47
• 第二篇 酿酒酵母 Ndl1 蛋白的初步晶体学研究47-69
• 第一章 研究背景概述47-56
• 1.1 细胞周期简介47-48
• 1.2 有丝分裂过程48-50
• 1.3 动力蛋白的结构和功能50-52
• 1.3.1 动力蛋白的结构51
• 1.3.2 细胞质动力蛋白的功能51-52
• 1.4 Ndl1 蛋白在动力蛋白调控中的作用52-56
• 1.4.1 动力蛋白调控蛋白52
• 1.4.2 酿酒酵母Ndl1 的特征52-53
• 1.4.3 Ndl1 在细胞周期中的出现情况53-54
• 1.4.4 Ndl1 的功能54-56
• 第二章 实验材料与方法56-60
• 2.1 质粒构建56
• 2.2 蛋白表达与纯化56-57
• 2.2.1 蛋白小量表达条件摸索56
• 2.2.2 扩大培养56
• 2.2.3 蛋白纯化56-57
• 2.3 晶体生长57
• 2.4 质粒改造57-59
• 2.4.1 设计质粒改造方法58
• 2.4.2 构建改造表达载体58-59
• 2.5 改造后重组蛋白的表达纯化59-60
• 第三章 实验结果及讨论60-65
• 3.1 全长蛋白表达及纯化60-61
• 3.1.1 小量表达结果60
• 3.1.2 蛋白纯化结果60-61
• 3.2 改造基因的克隆、蛋白表达和纯化61-62
• 3.2.1 改造基因的克隆61-62
• 3.3 改造后重组蛋白Ndl1△79 的表达纯化62-64
• 3.3.1 Ndl1△79 的小量表达结果62
• 3.3.2 Ndl1△79 的纯化结果62-64
• 3.4 Ndl1△79 蛋白晶体生长64-65
• 小结65-66
• 参考文献66-69
• 附录69-74
• 致谢74-75
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果75

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