草食动物厌氧真菌及其共存甲烷菌的分离鉴定和体外发酵特性的初步研究

【摘要】： 瘤胃是一个复杂的生态系统,里面栖居着大量的目前还不被人们完全了解的厌氧真菌、古菌、原虫和真细菌。这些微生物在瘤胃内的能量转化过程中起着重要的作用。甲烷是瘤胃微生物代谢的终产物之一,对动物而言它是能量的损失,对环境而言是温室气体之一,然而对能源而言它又是可燃性气体,因此瘤胃产甲烷菌的研究越来越受到重视。甲烷菌处于厌氧代谢链的最低端,在漫长的历史进化过程中,自然选择的压力使它必然与代谢链上端微生物密切联系。厌氧真菌和甲烷菌之间的种间氢转移,使这两种微生物紧密联系在一起。利用这一关系,进行体外研究厌氧真菌和甲烷菌在瘤胃内的实际关系将为瘤胃微生物研究提供新的思路。 第一部分：厌氧真菌和甲烷菌共培养物分离纯化利用厌氧滚管技术对6个草食动物来源的样品进行厌氧真菌与甲烷菌共培养物的分离纯化。在分离过程中以厌氧真菌菌落为分离参照。结果表明,在分离纯化到的12个共培养物中,有9个培养物含有厌氧真菌和甲烷菌,且产生甲烷,3个培养物存在厌氧真菌但不含产甲烷菌,不产生甲烷。形态学观察和DAPI细胞核染色初步鉴定显示,9个产甲烷共培养物中的厌氧真菌及3个不产甲烷培养物中的厌氧真菌分别属于Piromyces,Anaeromyces和Neocallimastix属。对产甲烷共培养物中的产甲烷菌进行DGGE和16SrRNA基因序列分析显示,每个共培养物中均仅有一株甲烷菌,并且这9个共培养物中的甲烷菌均属于甲烷短杆菌。结论,厌氧真菌和甲烷菌存在密切的共生关系,通过厌氧滚管技术可将联系紧密的厌氧真菌和产甲烷菌共培养物分离纯化出来。 第二部分：厌氧真菌和甲烷菌共培养物及纯厌氧真菌体外发酵特性的比较结果表明：各共培养物发酵后,干物质消失率在33%-49%之间。分离自水牛新鲜粪样的共培养物I2,产气量(150.2 mL)、甲烷产量(21.4 mL)、干物质消失率、木聚糖酶酶活都为最高(P0.05),而分离自山羊瘤胃液的共培养物F1和F2,其总产气量、甲烷产量较菌株I2稍低,但生长延滞期较短,发酵速度快。分离自骡子的两个共培养物L1和L2的总产气量、甲烷产量和干物质消失率都显著低于分离自反刍动物的共培养物(P0.05),但它们之间的酶活相差不显著(P0.05)。3个分离自单胃草食动物马和驴的纯厌氧真菌发酵96h,总产气量(仅为64.4 mL,22.1 mL,29.4 mL)及CMCase和木聚糖酶酶活显著低于厌氧真菌和甲烷菌共培养物的总产气量(P0.05)。各共培养物产生的木聚糖酶远远高于其所产生的CMCase酶活,并且大部分共培养物产生的CMCase酶活差异不显著(P0.05)。结论,不同共培养物发酵同一底物的能力有显著差异。 第三部分：厌氧真菌和甲烷菌共培养物转化木质化纤维素生成甲烷的研究对共培养物I2、F1、N3的研究发现,它们利用不同木质化纤维素底物生成甲烷的能力具有相似的趋势。三个共培养物转化效率均最高的底物是玉米芯(I2、F1、N3：干物质消失率66.39%、64.96%、60.26%；甲烷产量41.4 mL,31.0mL,32.6 mL)(P0.05),其次是甘蔗渣、小麦秸秆、玉米杆、小麦麸皮、DDGS,然而这三个共培养物都不利用锯屑生长。对结果进一步分析显示,这三个共培养物的总产气量分别与各自的甲烷产量(R20.98)和干物质消失率呈线性正相关(R20.90)。此外,I2、F1、N3分泌到培养液中的纤维水解酶酶活,也以玉米芯为最高,其次是甘蔗渣和小麦秸秆(P0.05)。虽然,培养液上清中的CMCase和木聚糖酶酶活有随着总产气量的升高而升高的趋势,但与总产气量没有线性关系。 第四部分：厌氧真菌和甲烷菌共培养物以及去除甲烷菌的共培养物发酵特性的研究本试验利用厌氧真菌对氯霉素不敏感的特性去除共培养物中的甲烷菌,研究共培养物以及去除甲烷菌的共培养物的发酵特性。研究结果显示,用氯霉素去除I2、F1、F2、N1、N2、N3、L1、L2中的甲烷菌后,仅有F1、F2、N1、N2、N3中的厌氧真菌存活。对共培养物(F1-A和N3-A)以及去除共培养物中的甲烷菌后获得的纯厌氧真菌(F1-B和N3-B)的进一步研究结果显示,厌氧真菌和甲烷菌共培养生长延滞期显著短于厌氧真菌纯培养,1/2总产气量时的发酵速率、总产气量、干物质消失率、CMCase和木聚糖酶酶活均高于厌氧真菌纯培养(P0.05)。在共培养物的培养液中乙酸积累是纯培养的两倍多,甲酸几乎没有积累。与纯培养相比共培养物中乳酸积累的量差异不显著,少于1 mM(P0.05)。 【关键词】：厌氧真菌 甲烷菌 共培养 甲烷
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S852.6
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 缩略符号10-11
• 引言11-12
• 文献综述12-40
• 1 厌氧真菌12-21
• 2 产甲烷菌21-25
• 3 草食动物胃肠道中厌氧真菌和甲烷菌的相互关系25-28
• 4 共培养的研究前景和意义28-30
• 参考文献30-40
• 试验研究40-85
• 第一章 草食动物厌氧真菌及其共存甲烷菌的分离鉴定40-54
• 1.材料与方法40-45
• 2.结果45-46
• 3.讨论46-50
• 参考文献50-52
• 英文摘要52-54
• 第二章 厌氧真菌和甲烷菌共培养物以及纯厌氧真菌发酵稻草的研究54-64
• 1.材料与方法54-57
• 2.结果57-59
• 3.讨论59-61
• 参考文献61-63
• 英文摘要63-64
• 第三章 厌氧真菌和甲烷菌共培养物发酵不同底物的研究64-77
• 1.材料与方法65-67
• 2.结果67-71
• 3.讨论71-73
• 参考文献73-76
• 英文摘要76-77
• 第四章 厌氧真菌和甲烷菌共培养物以及去除甲烷菌的共培养物发酵玉米芯的比较研究77-85
• 1.材料与方法77-80
• 2.结果80-82
• 3.讨论82-83
• 参考文献83-84
• 英文摘要84-85
• 全文结论85-86
• 致谢86-87
• 附录一87-88
• 附录二88

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