茶皂素抑制湖羊甲烷生成的微生物学机制研究

【摘要】： 瘤胃甲烷的生成不仅造成饲料能量的损失,而且通过喛气排入大气的甲烷是一种重要的温室气体,因此减少反刍动物的甲烷排放越来越受到社会关注。本试验以植物提取物茶皂素为试验材料,研究其对湖羊甲烷产量和瘤胃发酵的影响;利用荧光定量PCR技术分析检测瘤胃微生态主要菌群的变化；并进一步以变性梯度凝胶电泳结合rDNA序列分析技术,研究瘤胃原虫和甲烷菌的区系结构和种群变化,初步探讨茶皂素降低甲烷排放的微生物学机制。 试验一茶皂素对湖羊甲烷产量和瘤胃发酵的影响 以十二烷基硫酸钠为驱原虫药物对瘤胃瘘管湖羊进行两周驱虫处理,随后一半湖羊接种正常瘘管羊的瘤胃液以重新具虫,研究添加、不添加茶皂素对具虫、驱虫湖羊的甲烷产量和瘤胃发酵的影响。试验分为4个处理组：具虫基础料组,具虫茶皂素组,驱虫基础料组,驱虫茶皂素组,茶皂素添加量3g/头·天,试验持续21天。试验结束前一周,利用简易呼吸代谢室连续48h取样,测定湖羊甲烷产量。试验结束时连续两天于晨饲前及后3、6、12h取瘤胃液样品,分析瘤胃发酵参数。结果显示,茶皂素可以有效抑杀原虫。添加茶皂素和驱虫均可有效抑制瘤胃甲烷的排放,茶皂素的甲烷抑制效果(10.6%)和驱除原虫(12.7%)相当。驱虫和添加茶皂素均显著降低瘤胃液pH值(P＜0.05),但均处于正常范围内。与具虫基础料组相比,其余三个处理组的氨态氮浓度均显著降低(P＜0.05),下降幅度分别为12.9%、31.2%、33.9%：微生物蛋白产量显著提高(P＜0.05),提高比率达16.4%、29.2%、36.0%。各处理组的总挥发性脂肪酸没有显著差异,但单一脂肪酸摩尔百分含量有变化。与具虫基础料组比较,三个处理组的乙酸百分比和乙酸丙酸比都显著降低(P＜0.05)。驱虫组与具虫组比较,丙酸百分比显著提高(P＜0.05),丁酸百分比显著降低(P＜0.05),但两驱虫组间和两具虫组间差异均不显著。上述结果表明,在具原虫情况下,添加茶皂素可以降低甲烷产量,提高微生物蛋白浓度和丙酸百分比,改善乙丙比；而在驱原虫情况下,茶皂素作用不强。 试验二茶皂素对湖羊瘤胃微生态的影响 将每头羊各时间点的瘤胃液样品1mL进行混合,取混合样品1mL以珠磨法提取基因组DNA,采用荧光定量PCR方法测定瘤胃甲烷菌、原虫、真菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌相对于瘤胃总细菌16S rDNA的量；以变性梯度凝胶电泳研究瘤胃总菌区系,再结合rDNA序列分析技术研究瘤胃原虫和甲烷菌的区系变化。结果显示,甲烷菌相对于总细菌16S rDNA的数量,驱虫组较具虫组显著下降(P＜0.05),驱虫两组之间和具虫两组之间均无显著差异,添加茶皂素和驱除原虫之间没有互作效应。茶皂素显著抑制原虫数量,具虫茶皂素组较具虫基础料组显著减少(P＜0.05)。驱虫组的真菌数量较具虫组显著减少(P＜0.05),而在两具虫组之间和两驱虫组之间均无差异。纤维分解菌中,白色瘤胃球菌相对于总细菌16S rDNA的数量在不同处理组间无差异；驱虫茶皂素组的黄色瘤胃球菌的相对数量较其它3组显著降低(P＜0.05)。产琥珀酸丝状杆菌相对于总细菌16S rDNA的数量变化明显,具虫茶皂素组较具虫基础料组显著下降(P＜0.05),驱虫对其抑制作用更显著。溶纤维丁酸弧菌的数量,驱虫组与具虫组比较,显著升高(P0.05)。DGGE结果显示,茶皂素不显著影响瘤胃细菌的条带数和区系,而驱虫显著改变了两者。茶皂素显著影响瘤胃原虫的条带数和区系结构,对原虫有明显的抑制作用。茶皂素对甲烷菌条带数目的影响明显,但对其多样性没有显著影响,驱虫对条带数和多样性指数影响显著。本试验结果表明,茶皂素的添加可以显著抑制原虫生长,但对甲烷菌的相对数量没有明显影响。茶皂素对纤维分解菌——真菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌没有不良作用,但显著抑制产琥珀酸丝状杆菌的生长。茶皂素对甲烷菌区系结构不产生影响,但改变了原虫区系。 综上所述,茶皂素可以抑杀原虫,显著抑制瘤胃甲烷排放,改善瘤胃发酵,但甲烷产量的降低与甲烷菌数量的减少没有紧密的对应关系,推测茶皂素抑制甲烷生成是基于其对原虫的作用而间接产生。 【关键词】：茶皂素 发酵参数 甲烷产量 原虫 甲烷菌 荧光定量PCR 变性梯度凝胶电泳
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S826
【目录】：

• 目录4-7
• 图表一览表7-9
• 缩略词9-10
• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 第一章 文献综述14-30
• 第一节 瘤胃甲烷的产生与调控14-20
• 1 甲烷菌概述14-17
• 2 瘤胃甲烷的生成17-18
• 3 瘤胃甲烷的调控18-20
• 第二节 植物皂甙的作用20-24
• 1 皂甙特性及分类20
• 2 皂甙的理化作用及在反刍动物中的应用20-22
• 3 茶皂素的作用及应用研究22-24
• 第三节 瘤胃微生物研究中的分子生物学技术24-28
• 1 定量PCR技术24-25
• 2 16S/18S rRNA/rDNA序列分析技术25
• 3 变性梯度凝胶电泳技术25-26
• 4 荧光原位杂交技术26-27
• 5 限制性片段长度多态性分析技术27-28
• 第四节 本研究的目的意义和主要内容28-30
• 1 本研究的目的意义28
• 2 主要研究内容28-30
• 第二章 茶皂素对湖羊甲烷产量和瘤胃发酵的影响30-46
• 第一节 茶皂素对湖羊甲烷产量的影响30-36
• 1 材料和方法30-33
• 2 结果与分析33-34
• 3 讨论34-35
• 4 小结35-36
• 第二节 茶皂素对湖羊瘤胃发酵参数的影响36-46
• 1 材料和方法36-38
• 2 结果与分析38-43
• 3 讨论43-45
• 4 小结45-46
• 第三章 茶皂素对瘤胃微生态的影响46-75
• 第一节 茶皂素对瘤胃微生物菌群数量的影响46-53
• 1 材料和方法46-49
• 2 结果与分析49
• 3 讨论49-51
• 4 小结51-53
• 第二节 瘤胃细菌区系研究53-59
• 1 材料和方法53-55
• 2 结果与分析55-57
• 3 讨论57-58
• 4 小结58-59
• 第三节 瘤胃原虫区系研究59-67
• 1 材料和方法59-61
• 2 结果与分析61-64
• 3 讨论64-66
• 4 小结66-67
• 第四节 瘤胃甲烷菌区系研究67-72
• 1 材料和方法67-68
• 2 结果与分析68-70
• 3 讨论70-71
• 4 小结71-72
• 第五节 瘤胃甲烷菌的系统发育研究72-75
• 1 材料和方法72
• 2 结果与分析72-73
• 3 讨论73-74
• 4 小结74-75
• 第四章 结论、创新点和后续研究展望75-76
• 1 结论75
• 2 创新点75
• 3 后续研究展望75-76
• 参考文献76-84
• 致谢84

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