二氯甲烷降解菌的分离鉴定、微生物菌剂及基因文库的构建研究

【摘要】：本研究探讨二氯甲烷的微生物降解。从长期被卤代脂肪烃污染的曝气池中获得活性污泥,首先在对活性污泥进行定向驯化后,在特定的载体上进行了发酵扩大培养,制备了二氯甲烷生物处理复合微生物菌剂。实验制备得到复合微生物菌剂成品,可方便投加使用。通过对pH、烘干温度、载体比例的考察,利用正交试验,确定了复合微生物菌剂制备的最佳工艺,其最佳pH为7;最佳烘干温度为35℃;最佳载体比例(麦麸:纤维素:稳定剂)为85%:10%:5%。在二氯甲烷浓度为800 mg/L的水溶液中,经过168 h后可降解25.81%。制备的菌剂具有较好的稳定性,可在常温下稳定保存30 d的时间,4℃下可保存60 d甚至更长的时间而仍保持对二氯甲烷的去除效率。 从定向驯化的活性污泥中,分离筛选得到1株二氯甲烷降解菌株,通过菌株形态学观察、生理生化测试、16S rDNA序列同源性以及Biolog综合分析,确定为梭形芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis),查阅相关文献,未发现该菌株具有降解二氯甲烷的报道,因此,可将该菌株视为二氯甲烷生物降解的新菌株,命名为WH22。当处于二氯甲烷浓度为800 mg/L体系中,WH22经过168 h,降解率为22.7%。 对筛选得到的菌株WH22进行~(60)Coγ射线和紫外线复合诱变育种,选育得到3株正突变株zt-4,zt-5,zt-10,在相同条件下,二氯甲烷的降解率分别达到了66.2%,52.9%,52.1%,较之原始出发菌株,分别提高了191.63%,133.04%,129.52%。以pH、温度和无机氮源为考察因素,通过正交实验考察了正突变株的最佳降解工艺,得到其最佳的降解条件为pH 7.0,温度30℃,无机氮源(NH_4)_2SO_4。同时,经过传代实验,zt-10的正突变株的遗传稳定性最好,而对于代号为zt-4和zt-5的正突变株,定期筛选和复壮是必要的。 对降解菌株WH22进行基因文库的构建,提取得到了符合构库要求的基因组DNA,有较高的纯度与浓度,呈典型的核酸吸收特征。通过梯度浓度酶切得到的最佳酶切体系,以pUC19质粒DNA为连接载体,经处理得到了连接需要的线性DNA。但最后没有得到有效的转化子。 【关键词】：二氯甲烷 生物降解 复合微生物菌剂 基因文库
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：X172
【目录】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 符号说明12-13
• 第一章 绪论13-27
• 1.1 二氯甲烷的危害13-16
• 1.1.1 二氯甲烷的污染现状13-14
• 1.1.2 二氯甲烷的物理化学性质14
• 1.1.3 二氯甲烷的毒性14-15
• 1.1.4 国家标准15-16
• 1.2 二氯甲烷含量的测定方法16-17
• 1.2.1 现场应急检测方法16
• 1.2.2 实验室检测方法16
• 1.2.3 水体中的二氯甲烷含量测定16-17
• 1.2.4 空气中二氯甲烷含量的测定17
• 1.2.5 土壤中的二氯甲烷含量测定17
• 1.3 二氯甲烷生物降解技术17-19
• 1.3.1 二氯甲烷生物降解机理18
• 1.3.2 参与降解二氯甲烷的菌种18-19
• 1.3.3 菌体在生物法处理二氯甲烷中的应用19
• 1.4 复合微生物菌剂的研究进展19-22
• 1.4.1 农业领域20
• 1.4.2 环保领域20-22
• 1.5 二氯甲烷微生物降解研究进展22-25
• 1.5.1 微生物22
• 1.5.2 降解菌关键酶的生化反应特征22-23
• 1.5.3 二氯甲烷脱卤酶的基因型23-24
• 1.5.4 二氯甲烷脱卤酶的表达调节24-25
• 1.6 课题研究意义和内容25-27
• 1.6.1 课题研究意义25
• 1.6.2 课题研究内容25-26
• 1.6.3 课题创新之处26-27
• 第二章 材料与分析方法27-36
• 2.1 实验材料27-29
• 2.1.1 活性污泥27
• 2.1.2 培养基27
• 2.1.3 菌剂的载体组成27-28
• 2.1.4 实验药品28-29
• 2.1.5 实验仪器29
• 2.2 分析检测项目与方法29-36
• 2.2.1 工艺参数测定29-30
• 2.2.2 活性污泥定向驯化方法30-31
• 2.2.3 复合微生物菌剂制备方法31
• 2.2.4 菌剂制备参数优化及其稳定性实验31-32
• 2.2.5 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析32
• 2.2.6 降解菌株的分离纯化32-33
• 2.2.7 微生物形态观察33
• 2.2.8 菌种鉴定33
• 2.2.9 二氯甲烷降解菌株的复合诱变育种33-34
• 2.2.10 二氯甲烷降解菌基因组文库的初步构建34-36
• 第三章 二氯甲烷复合微生物菌剂的研制及制备工艺36-47
• 3.1 材料与方法36
• 3.1.1 实验材料36
• 3.1.2 实验方法36
• 3.2 结果与讨论36-45
• 3.2.1 活性污泥的定向驯化36-37
• 3.2.2 复合微生物菌剂的基本形态特征37-38
• 3.2.3 pH 值对微生物复合菌剂降解效率的影响38-39
• 3.2.4 烘干温度对微生物复合菌剂降解效率的影响39-40
• 3.2.5 复合微生物菌剂最佳制备工艺正交实验40-42
• 3.2.6 复合微生物菌剂稳定性试验42-44
• 3.2.7 复合微生物菌剂群落特征分析44-45
• 3.3 本章小结45-47
• 第四章 二氯甲烷降解菌的分离、筛选及降解特性47-56
• 4.1 材料与方法47
• 4.1.1 实验材料47
• 4.1.2 实验方法47
• 4.2 结果与讨论47-54
• 4.2.1 二氯甲烷降解菌株的分离纯化47-48
• 4.2.2 菌株的形态学特征48-49
• 4.2.3 菌株的16S rDNA 序列分析及系统发育树的构建49-52
• 4.2.4 菌株的Biolog 实验结果52-54
• 4.2.5 菌株WH22 对二氯甲烷的降解特性初探54
• 4.3 本章小结54-56
• 第五章 二氯甲烷高效降解菌株的诱变选育56-66
• 5.1 材料与方法57
• 5.1.1 实验材料57
• 5.1.2 实验方法57
• 5.2 结果与讨论57-64
• 5.2.1 ~(60)Coγ射线致死率和存活率57-58
• 5.2.2 ~(60)Coγ射线正突变菌株的筛选58-59
• 5.2.3 紫外诱变致死率确定59-60
• 5.2.4 诱变正突变菌株的筛选60-62
• 5.2.5 正交实验结果62-63
• 5.2.6 突变株遗传稳定性考察63-64
• 5.3 本章小结64-66
• 第六章 二氯甲烷降解菌基因组文库的初步构建66-73
• 6.1 材料与方法66
• 6.1.1 实验材料66
• 6.1.2 实验方法66
• 6.2 结果与讨论66-72
• 6.2.1 高质量基因组DNA 的获得66-67
• 6.2.2 基因组DNA 的酶切和片段回收67-69
• 6.2.3 载体pUC19 质粒DNA 的酶切与去磷酸化处理69-72
• 6.2.4 连接、转化及转化子的筛选72
• 6.3 本章小结72-73
• 第七章 结论与建议73-76
• 7.1 结论73-75
• 7.2 建议75-76
• 参考文献76-81
• 致谢81-82
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文82

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