厌氧颗粒污泥产甲烷菌群功能基因克隆及分析研究

【摘要】：产甲烷菌群是厌氧颗粒污泥中的重要功能菌群。甲基辅酶M还原酶（MCR）是产甲烷菌所特有的酶，mcrA基因编码MCR的α亚基。本论文以取自工业化UASB反应器中处理维生素B12和阿维菌素废水的厌氧颗粒污泥为研究对象，采用PCR-DGGE、基因克隆文库等分子生物学手段，基于mcrA基因对厌氧颗粒污泥中的产甲烷菌群组成和结构进行研究，获取产甲烷菌群的多样性、系统发育关系等信息。此外，还对构建出的功能基因工程菌对厌氧颗粒污泥产甲烷活性的影响进行初步研究。研究获得以下结果： 对不同污泥样品基于mcrA基因所得的DGGE图谱条带模式存在差异，表明在不同环境中产甲烷菌群结构有所不同，产甲烷菌群中优势种群易受环境影响而发生变化。根据DGGE图谱计算不同污泥样品的产甲烷菌群多样性指数、丰富度指数和优势度指数，结果显示，由于两种工业废水的特性不同造成环境压力的差异，导致相应厌氧颗粒污泥中产甲烷菌群的多样性不同，处理维生素B12废水的污泥样品的产甲烷菌群显示出更高的多样性和丰富度。 将两种污泥样品DGGE图谱条带进行测序分析比对，确定了污泥中产甲烷菌的优势种属，并对其进行系统发育分析。其中，维生素B12厌氧颗粒污泥中，产甲烷八叠球菌目甲烷鬃菌属为优势种属，此外，还有少量甲烷杆菌目；阿维菌素厌氧颗粒污泥中，产甲烷八叠球菌目甲烷鬃菌属为优势种属，此外，还有一部分为甲烷八叠球菌属和甲烷杆菌目。 采用构建基因克隆文库的方法基于mcrA基因对两种污泥样品进行研究，结果显示：处理维生素B12废水的厌氧颗粒污泥中的产甲烷菌有产甲烷八叠球菌目、产甲烷微菌目和产甲烷杆菌目，其中，产甲烷八叠球菌目为优势种群；处理阿维菌素废水的厌氧颗粒污泥中的产甲烷菌多样性相对较低，只检测出产甲烷八叠球菌目和产甲烷杆菌目，其中，产甲烷八叠球菌目甲烷鬃菌属为优势种属。 克隆文库与PCR-DGGE对厌氧颗粒污泥产甲烷菌群的分析结果存在一定差异。就VB12厌氧颗粒污泥而言，两种方法均检测出产甲烷八叠球菌目为优势种群，而少量的产甲烷微菌目仅被克隆文库检测到，表明构建基因克隆文库能更全面的获取菌群组成信息。 在构建基因克隆文库的过程中，得到功能基因工程菌，考察其对厌氧颗粒污泥产甲烷活性的影响，结果发现：投加基因工程菌降低了厌氧颗粒污泥的累积产甲烷量，但提高了厌氧颗粒污泥的最大产甲烷速率。同时，投加基因工程菌后，系统pH值降低的速度和程度均有所增大。由此推测，基因工程菌的投加，可能有利于产酸过程，进而提高产甲烷速率；同时，乙酸加速积累导致pH值快速降低，抑制了产甲烷菌的活性，造成厌氧颗粒污泥的累积产甲烷量明显降低。 【关键词】：厌氧颗粒污泥 产甲烷菌群分析 克隆文库 PCR-DGGE 生物强化 产甲烷活性
【学位授予单位】：河北科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-21
• 1.1 厌氧颗粒污泥10-13
• 1.1.1 厌氧颗粒污泥的特性10-11
• 1.1.2 厌氧颗粒污泥的形成11-13
• 1.2 厌氧颗粒污泥中的主要菌群13-14
• 1.2.1 水解发酵菌13
• 1.2.2 产乙酸菌13-14
• 1.2.3 产甲烷菌14
• 1.3 产甲烷菌的研究进展14-17
• 1.3.1 传统的微生物学分析方法14-15
• 1.3.2 基于 16S rRNA 的分子生物学方法15
• 1.3.3 基于功能基因的分子生物学方法15-17
• 1.4 生物强化技术17-20
• 1.4.1 特定功能微生物的选育17-18
• 1.4.2 生物强化作用原理18-19
• 1.4.3 生物强化技术在废水处理中的应用19-20
• 1.5 本课题研究内容与意义20-21
• 1.5.1 研究内容20
• 1.5.2 研究目的与意义20-21
• 第2章 实验材料和方法21-28
• 2.1 实验材料21
• 2.2 实验方法21-28
• 2.2.1 颗粒污泥总 DNA 提取方法21-22
• 2.2.2 聚合酶链式反应（PCR）22
• 2.2.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）22-24
• 2.2.4 克隆24-26
• 2.2.5 基因工程菌对厌氧颗粒污泥产甲烷活性的影响26-28
• 第3章 厌氧颗粒污泥中产甲烷菌群 PCR-DGGE 分析28-35
• 3.1 厌氧颗粒污泥总 DNA 的提取28-29
• 3.2 功能基因的 PCR 扩增29
• 3.3 厌氧颗粒污泥中产甲烷菌群分析29-33
• 3.3.1 菌群多样性分析29-31
• 3.3.2 菌群结构分析31-33
• 3.3.3 菌群功能分析及比较33
• 3.4 本章小结33-35
• 第4章 厌氧颗粒污泥中产甲烷菌群克隆文库构建及种群分析35-41
• 4.1 功能基因的纯化及定量35
• 4.2 阳性克隆的筛选35-36
• 4.3 阳性克隆的鉴定36-37
• 4.4 产甲烷菌功能基因克隆文库构建及种群分析37-40
• 4.4.1 处理 VB12废水的厌氧颗粒污泥中的产甲烷菌群分析37-38
• 4.4.2 处理阿维菌素废水的厌氧颗粒污泥中的产甲烷菌群分析38-39
• 4.4.3 菌群功能分析及比较39-40
• 4.5 本章小结40-41
• 第5章 厌氧颗粒污泥产甲烷过程的生物强化41-49
• 5.1 基因工程菌对厌氧颗粒污泥产甲烷活性的影响41-44
• 5.2 不同 pH 值下基因工程菌对厌氧颗粒污泥产甲烷活性的影响44-48
• 5.3 本章小结48-49
• 结论49-51
• 参考文献51-56
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文56-57
• 致谢57

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