甲烷氧化菌素的生物合成及模拟过氧化物酶研究

【摘要】：甲烷氧化菌是一种能够利用甲烷等单碳化合物为碳源进行生长的微生物,甲烷氧化菌素(methanobactin, mb)是甲烷氧化菌向周围环境中释放的一种铜捕获小肽,它通过与铜结合参与了颗粒性甲烷单加氧酶复合物的构建和向催化反应中心的电子传递,具有氧化还原活性。本论文主要研究了甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium3011的高密度培养方式获得甲烷氧化菌素(mb),甲烷氧化菌素(mb)的纯化方法及结构表征,以及Mb作为过氧化物模拟酶反应动力学方面的研究。具体的研究内容包括： 根据甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium3011能够利用甲醇作碳源并优于甲烷的特点,建立了一个甲醇在线监测并自动添加的培养方法,结果表明甲醇可以代替甲烷作为碳源；当甲醇的最佳添加量为0.1%(V/V)时,间歇性添加甲醇发酵终止后的细胞密度为1.622g dry wt L-1,生长速率相对于甲烷提高到0.043h-1,但细胞生长的延滞期较长,为59.6254h,培养时间为7d；而相比较通过在线监测自动添加甲醇,发酵终止后的细胞密度为1.772g dry wt L-1,生长速率提高至0.056h-1,细胞生长的延滞期为37.1807h,培养时间为4d。说明在线监测自动添加甲醇缩短了细胞生长的延滞期,并且减少了发酵时间,使积累mb的时间也大大降低,促进了细胞的高密度生长。 在对大孔树脂动态吸附法纯化mb的条件进行研究后发现,mb的大孔树脂动态吸附的最佳条件为洗脱液为60%乙醇水溶液,样品流速为2mL/min,上样量上限为400mL。经大孔树脂动态吸附得到的mb,再经supelco LC-C18固相萃取柱和固定化金属亲和层析柱进行进一步纯化可用于液质分析。 根据紫外-可见吸收光谱扫描mb样品的结果表明mb分子中含有硫酰氧唑基团使其在394nnl附近处产生吸收峰。螯合铜后的mb分子,在394nm附近处的吸收峰减小。荧光光谱扫描mb样品的结果推测mb的硫酰唑酮基团可能使其与Cu(Ⅱ)结合,质谱分析mb样品的结果表明核质比(m/z)为1215.696的物种与文献报道的[Mb-2H+63Cu+]1-物种的核质比(m/z)1215.7完全一致。核质比(m/z)为927.667的物种为水解掉丝氨酸,半胱氨酸,蛋氨酸和异丁醇的Mb-Cu。上述谱学表征结果证明经本文方法纯化的Mb具有与Cu(Ⅱ)结合的能力。 经过催化过氧化氢氧化对苯二酚反应的实验,证明了Mb-Cu可以具备过氧化物模拟酶的能力,因此构建了Mb-Cu作为过氧化物模拟酶的反应动力学模型,利用紫外-可见分光光度法研究了Mb-Cu催化过氧化氢氧化对苯二酚的动力学。并对影响其反应动力学的因素进行了研究,结果表明发现Mb-Cu未被稀释时催化反应速率最快,最适对苯二酚浓度为5×10-4mol/L,最适H202浓度为7×10-3mol/L,该反应是符合三元复合物模型,得出Mb-Cu形成的配合物比生物酶具有更高的热稳定性,温度60℃该模拟物催化活性最大,并且在较高温度下活性配合物仍能保持较高的催化活性,不会失活和变性。 【关键词】：甲烷氧化菌 甲烷氧化菌素 动力学 模拟过氧化物酶
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：TQ920.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 绪论12-21
• 1.1 甲烷氧化菌素概况12-17
• 1.1.1 甲烷氧化菌12-13
• 1.1.2 甲烷氧化菌的特征酶13-15
• 1.1.3 铜在甲烷氧化菌细胞内的作用15-16
• 1.1.4 甲烷氧化菌素的发现16-17
• 1.1.5 甲烷氧化菌素的结构17
• 1.2 甲烷氧化菌素的研究现状17-19
• 1.2.1 甲烷氧化菌素的金属螯合性17-18
• 1.2.2 甲烷氧化菌素的氧化酶活性18-19
• 1.2.3 甲烷氧化菌素的抗菌性19
• 1.3 本课题来源及研究的意义19-20
• 1.3.1 课题来源19
• 1.3.2 甲烷氧化菌素的研究意义19-20
• 1.4 论文的研究内容20-21
• 2 甲烷氧化菌素的生物合成21-34
• 2.1 引言21
• 2.2 实验材料与仪器21-22
• 2.2.1 实验材料21-22
• 2.2.2 实验仪器22
• 2.3 实验方法22-26
• 2.3.1 甲烷为碳源细胞培养方法的建立22-23
• 2.3.2 甲烷氧化菌的甲醇驯化培养23
• 2.3.3 以甲烷为碳源培养对甲基弯菌IMV 3011菌体生长的影响23
• 2.3.4 间歇性添加甲醇对甲基弯菌IMV 3011菌体生长的影响23-24
• 2.3.5 在线监测自动添加甲醇对甲基弯菌IMV 3011菌体生长的影响24-25
• 2.3.6 甲烷氧化菌素含量测定方法25
• 2.3.7 数据处理25-26
• 2.4 数据结果与分析26-32
• 2.4.1 以甲烷为碳源甲基弯菌IMV 3011菌体生长状况26
• 2.4.2 间歇性添加甲醇对甲基弯菌IMV 3011菌体生长的影响26-27
• 2.4.3 间歇性添加和自动添加甲醇对甲基弯菌IMV3011生长延滞期的影响27-29
• 2.4.4 间歇性添加甲醇的甲醇消耗状况29-30
• 2.4.5 自动添加甲醇对甲基弯菌IMV 3011菌体生长的影响30-31
• 2.4.6 自动添加甲醇的甲醇消耗状况31
• 2.4.7 工作曲线测定结果31
• 2.4.8 间歇性添加甲醇与自动添加甲醇产mb的量的比较31-32
• 2.5 本章小结32-34
• 3 甲烷氧化菌素的纯化、结构表征研究34-42
• 3.1 引言34
• 3.2 实验仪器与材料34-35
• 3.2.1 实验仪器34
• 3.2.2 实验材料34-35
• 3.3 实验方法35-37
• 3.3.1 大孔树脂法纯化甲烷氧化菌素35-36
• 3.3.2 C_(18)固相萃取柱纯化甲烷氧化菌素36
• 3.3.3 甲基弯菌IMV3011甲烷氧化菌素紫外分析、荧光光谱、质谱36-37
• 3.4 结果与分析37-40
• 3.4.1 大孔树脂动态吸附上样速度的确定37
• 3.4.2 大孔树脂动态吸附处理量的选择的确定37-38
• 3.4.3 大孔树脂动态吸附洗脱梯度的确定38
• 3.4.4 甲基弯菌IMV3011甲烷氧化菌素的结构表征38-40
• 3.5 本章小结40-42
• 4 甲烷氧化菌素-铜模拟过氧化物酶催化过氧化氢氧化对苯二酚的动力学研究42-51
• 4.1 引言42-43
• 4.2 实验仪器与材料43-44
• 4.2.1 实验仪器43
• 4.2.2 实验材料43-44
• 4.3 实验方法44-47
• 4.3.1 Mb的制备44
• 4.3.2 Mb-Cu催化H_2O_2氧化对苯二酚反应44
• 4.3.3 Mb-Cu催化氧化对苯二酚的动力学模型44-45
• 4.3.4 动力学测定45-47
• 4.4 结果与分析47-50
• 4.4.1 Mb-Cu催化H_2O_2氧化对苯二酚反应过程的UV-vis光谱分析47-48
• 4.4.2 不同Mb-Cu浓度催化H_2O_2氧化对苯二酚的动力学结果48
• 4.4.3 不同对苯二酚浓度对Mb-Cu催化H_2O_2氧化对苯二酚动力学结果48-49
• 4.4.4 H_2O_2与催化剂Mb-Cu配比对反应的影响49
• 4.4.5 温度对催化反应的影响49-50
• 4.5 本章小结50-51
• 结论51-53
• 参考文献53-57
• 攻读学位期间发表的学术论文57-58
• 致谢58

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