高效产甲烷复合菌系的构建及应用研究

【摘要】：沼气发酵是一个由多种微生物参与、联合作用的复杂生化反应过程，是产甲烷菌和非产甲烷菌等多种微生物生长的动态平衡过程。产甲烷菌是该过程中的关键微生物，对沼气的产量和质量起着决定性作用。我国目前沼气生产多为自然接种，存在产气率低、产气不稳定、低温条件下沼气池利用率低等问题。因此，通过筛选性状优良、适于进行沼气生产的产甲烷菌，研究其生理生化特性和分类地位，确定影响其生长的各种因素，并通过自然以及人工构建高效沼气复合微生物菌系，最后应用于沼气生产，具有重要的意义。该研究不仅可以丰富产甲烷古菌菌种资源，所构建的复合菌系对增强沼气发酵各阶段微生物类群的活性，提高沼气产气效率和稳定性有极大的实用价值。 本实验采用改良的Hungate厌氧分离技术，从承德塞罕坝湿地污泥、石家庄污水处理厂等不同厌氧生境中分离到三株产甲烷菌，分别为菌株SHB、菌株AG和菌株QDW，经形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析确定其分类地位和生长特性。菌株SHB和AG属于产甲烷杆菌属（Methanobacterium sp.）；菌株SHB适宜生长温度范围为16-40oC，适宜pH为6.0-9.0，在0-5%盐浓度范围内能够生长，能够利用H2/CO2和甲酸钠；菌株AG最适生长温度为37oC，最适pH为7.5-8.0，在0-1%盐浓度范围内能够生长，利用H2/CO2和甲酸钠生长；菌株QDW属于甲烷袋状菌属（Methanoculleus sp.），最适生长温度为37oC，最适pH为7-7.5，不具有耐盐性，能够以甲酸钠、乙酸钠和H2/CO2为底物生长。对这三株菌的生理特性进行了比较，菌株SHB的生长温度和pH范围较宽，耐盐性和比生长率较高，将其用于构建复合菌系。 沼气发酵仅靠一种或少数几种菌培养物很难从整体上对沼气发酵进行调控。因此，分别在不同温度下对各样品进行富集驯化和组配，将其中几个效果较好的复合菌系与菌株SHB进行组配，得到人工构建的中温复合菌系C13、C14和B3以及低温复合菌系C2-1和C2-3。中温复合菌系中，复合菌系C13、C14和B3的产甲烷能力比组配前提高了4.44%、1.19%和9.41%，复合菌系C13和复合菌系B3显著高于对照，复合菌系C14与对照差异不显著；低温复合菌系中，复合菌系C2-1比对照组（复合菌系B2-1和菌株SHB）的产甲烷能力高5.74%和4.82%；复合菌系C2-3比对照组（复合菌系B2-3和菌株SHB）分别高20.48%和5.62%，组配后的复合菌系C2-1和复合菌系C2-3显著高于对照。 把中温复合菌系和低温复合菌系分别用于小型沼气发酵实验，在35oC中温条件下，加入复合菌系C13的处理组的产气量比对照组高37.41%，加入复合菌系C13的处理组的产气量显著高于加入复合菌系C14和复合菌系B3的处理组；在室温16oC条件下，加入复合菌系C2-3的处理组的产气量比对照组高32.84%，加入复合菌系C2-3的处理组的产气量显著高于加入复合菌系C2-1的处理组。 【关键词】：产甲烷菌 分离鉴定 复合菌系 沼气发酵
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：TQ221.11
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-22
• 1.1 沼气发酵12-14
• 1.1.1 沼气的生成过程12-13
• 1.1.2 沼气发酵的影响因素13-14
• 1.2 产甲烷菌14-18
• 1.2.1 细胞显微结构15
• 1.2.2 主要辅酶15-16
• 1.2.3 产甲烷菌生长的影响因素16-17
• 1.2.4 甲烷菌的分离17-18
• 1.3 沼气微生物菌群18-22
• 1.3.1 复合菌系的驯化、筛选及其构建18-20
• 1.3.2 菌群结构研究的分子生物学技术20-22
• 第2章 产甲烷菌的筛选22-42
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 采样地点22
• 2.1.2 培养基22-24
• 2.1.3 主要仪器24
• 2.2 实验方法24-29
• 2.2.1 富集培养24
• 2.2.2 分离纯化24-26
• 2.2.3 产甲烷古菌培养特征及其生理生化特性研究26-28
• 2.2.4 分子生物学鉴定28-29
• 2.2.5 菌种的保存29
• 2.3 结果29-41
• 2.3.1 样品富集29-30
• 2.3.2 菌株的分离30
• 2.3.3 菌株的形态观察30-32
• 2.3.4 生理生化32-37
• 2.3.5 生长曲线37-39
• 2.3.6 序列测定及系统发育树39-41
• 2.4 讨论41-42
• 第3章 产甲烷复合菌系的构建42-52
• 3.1 材料与方法42-43
• 3.1.1 菌种来源42
• 3.1.2 培养条件42-43
• 3.1.3 复合菌系的驯化与筛选43
• 3.1.4 复合菌系的构建43
• 3.2 结果43-50
• 3.2.1 中温复合菌系的构建43-48
• 3.2.2 低温复合菌系的构建48-50
• 3.3 讨论50-52
• 第4章 复合菌系在小型沼气发酵试验中的应用52-60
• 4.1 材料52
• 4.1.1 实验材料52
• 4.1.2 试剂52
• 4.1.3 主要仪器52
• 4.2 实验方法52-54
• 4.2.1 牛粪 TS 和 VS 含量的测定53
• 4.2.2 复合菌系用于沼气发酵的实验方法53-54
• 4.2.3 甲烷含量的测定54
• 4.2.4 pH 值的测定54
• 4.2.5 日产气量的测定54
• 4.2.6 总产气量的测定54
• 4.3 结果54-59
• 4.3.1 牛粪 TS 和 VS 含量54
• 4.3.2 甲烷含量54-55
• 4.3.3 pH 值55-56
• 4.3.4 日产气量56-58
• 4.3.5 总产气量58-59
• 4.4 讨论59-60
• 第5章 结论60-62
• 参考文献62-68
• 附录68-71
• 致谢71-72
• 攻读学位期间取得的科研成果72

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