嗜热自养甲烷杆菌的分离纯化和二硫键异构酶（MTH1745）的分子结构和功能研究

【摘要】： 古菌其古老的进化地位、奇特的生活习性和与此相关的潜在生物技术开发前景,赋予它迷人的科研价值。研究二硫键异构酶与古菌对环境的适应性和耐受性之间的关系,有利于揭示古菌适应极端环境的分子机理。 本研究用Hungate厌氧操作技术从温泉中分离纯化了1株嗜热产甲烷菌,命名为嗜热自养甲烷杆菌DX01(Methanothermobacter thermoautotrophicus DX01)。该菌株培养在60℃时呈短杆状,且菌落呈砖红色。分析不同温度生长的细胞全蛋白质图谱,分离得到70℃时表达上调的蛋白质——甲基辅酶M还原酶Ⅰ。 使用标准菌株嗜热自养甲烷杆菌ΔH~T全基因组序列,筛选了一个预测的ORF——MTH1745,被认为是二硫键异构酶。它含有一个Trx结构域,编码15一个氨基酸。运用实时定量PCR从mRNA水平分析了MTH1745在冷激处理、不同生长温度情况下的表达特征。结果表明,当温度偏离菌体最适生长温度(65℃)或冷激处理(4℃)后,MTH1745 mRNA的表达量会提高,在50℃和70℃时达到最大。表明MTH1745的表达与温度相关,当偏离最适生长温度时MTH1745 mRNA表达上调以帮助体内蛋白质正确折叠。 为了研究MTH1745的功能,成功地构建了E.coli(pET-28a-MTH1745)活性检测系统,MTH1745在51℃热胁迫60min能够提高胁迫后细胞的生存率23%。这一结果表明MTH1745对细胞受到热损伤后起到重要的保护作用。 本研究运用分子生物和生物化学技术全面地分析了MTH1745的还原酶,二硫键异构酶和分子伴侣活性。通过胰岛素混浊度实验检测了MTH1745蛋白的还原酶活性,表明MTH1745具有还原酶活性。MTH1745复性还原变性RNase A分析,表明MTH1745具有二硫键异构活性,其活力相当于人PDI的28%。在43℃MTH1745减少热诱发的柠檬酸合成酶的聚集23%,具有分子伴侣活性。 为进一步确定MTH1745的二硫键异构酶活性,本研究进行了MTH1745对DsbA的互补分析。结果显示菌株JCB573,JCB579,JCB580和JCB581分别回复了AP活性的19.81%,37.98%,26.34%和36.07%,表明MTH1745可部分功能互补大肠杆菌DsbA。 所有分析显示,MTH1745能帮助嗜热自养甲烷杆菌抵抗不适环境的变化,具有二硫键异构酶所共有的酶活特征(还原酶、二硫键异构和分子伴侣活性)。研究嗜热自养甲烷杆菌的二硫键异构酶有助于认识古菌的抗胁迫机制,有助于了解二硫键异构酶的系统发育,为生命的起源和进化提供更多的线索。 【关键词】：古菌 嗜热自养甲烷杆菌 胁迫 蛋白质二硫键异构酶 分子伴侣
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：Q93
【目录】：

• 目录4-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-12
• 第一章 文献综述12-36
• 1 嗜热自养甲烷杆菌12-17
• 2 蛋白质折叠17-21
• 3 二硫键异构酶21-31
• 3.1 真核蛋白质二硫键异构酶PDI22-29
• 3.2 大肠杆菌Dsb C29-31
• 3.3 古菌的二硫键氧化还原酶31
• 4 本研究的目的和内容31-32
• 5 参考文献32-36
• 第二章 嗜热自养甲烷杆菌DX01的分离纯化和特征研究36-55
• 1 引言36-37
• 2 材料37-38
• 2.1 试验材料37
• 2.2 主要试剂37-38
• 2.3 主要仪器38
• 3 方法38-45
• 3.1 嗜热自养甲烷杆菌的分离纯——Hungate技术38-39
• 3.2 102G气相色谱仪的参数39
• 3.3 透射式电子显微镜观察39
• 3.4 嗜热自养甲烷菌DNA的提取39-40
• 3.5 16S rDNA的克隆40-41
• 3.6 G+C mol%的测定41-42
• 3.7 DNA-DNA杂交42-43
• 3.8 PCR介导的DNA指纹图谱分析(PCR Melting Profiles)43-45
• 3.9 SDS-PAGE45
• 3.10 蛋白质N末端测序45
• 3.11 甲基辅酶M还原酶I的克隆45
• 4 结果45-53
• 4.1 M.thermoautotrophicus DX01的形态特征和生理生化分析45-51
• 4.2 M.thermoautotrophicus DX01抗胁迫蛋白质的分离与纯化51-53
• 5 讨论53-54
• 6 参考文献54-55
• 第三章 二硫键异构酶(MTH1745)的表达特征研究55-66
• 1 引言55-56
• 2 材料56
• 1.1 试验材料56
• 1.2 主要试剂56
• 1.3 主要仪器56
• 3 方法56-61
• 3.1 嗜热自养甲烷杆菌ΔH~T的培养——Hungate技术56-57
• 3.2 嗜热自养甲烷杆菌ΔH~T在不同温度的培养和冷激处理57
• 3.3 RNA的提取57-58
• 3.4 反转录(RT)58
• 3.5 Real-time PCR58-61
• 3.5.1 嗜热自养甲烷杆菌ΔH~T 16S rDNA的TA克隆58-60
• 3.5.2 二硫键异构酶(MTH1745)的TA克隆60
• 3.5.3 定量PCR60-61
• 4 结果61-64
• 4.1 二硫键异构酶(MTH1745)基因ORF的克隆61
• 4.2 二硫键异构酶(MTH1745)基因ORF和16S rDNA部分片段的克隆61-62
• 4.3 不同培养温度对二硫键异构酶(MTH1745)mRNA表达的影响62-63
• 4.4 冷激处理对二硫键异构酶(MTH1745)mRNA表达的影响63-64
• 5 讨论64-65
• 6 参考文献65-66
• 第四章 MTH1745对大肠杆菌热耐受性影响和过表达体系的构建66-81
• 1 引言66-67
• 2 材料67-68
• 2.1 试验材料67
• 2.2 主要试剂67
• 2.3 主要仪器67-68
• 3 方法68-74
• 3.1 二硫键异构酶(MTH1745)基因编码区的克隆68-69
• 3.2 pET-28a(+)—MTH1745原核表达系统的构建69-71
• 3.3 E.coli BL21(DE3)热耐受性实验71
• 3.4 E.coli(pSJS1240,pET-28a-MTH1745)过表达系统的构建71-72
• 3.5 二硫键异构酶(MTH1745)基因表达产物的Ni柱纯化72-73
• 3.6 二硫键异构酶(MTH1745)基因表达产物的透析复性73
• 3.7 蛋白质浓度的测定73
• 3.8 HPLC检测蛋白质纯度73-74
• 4 结果74-78
• 4.1 二硫键异构酶(MTH1745)编码区的克隆和pET-28a(+)-MTH1745原核表达系统的构建74
• 4.2 二硫键异构酶(MTH1745)基因在大肠杆菌中表达产物的检测74-75
• 4.3 诱导表达和E.coli BL21(DE3)热耐受性75-76
• 4.4 二硫键异构酶(MTH1745)基因原核表达产物胞内存在形式的鉴定76-77
• 4.5 SDS-PAGE检测纯化复性后二硫键异构酶(MTH1745)蛋白质77
• 4.6 HPLC检测纯化的二硫键异构酶(MTH1745)蛋白质77-78
• 5 讨论78-79
• 6 参考文献79-81
• 第五章 二硫键异构酶(MTH1745)的体外活性检测与分析81-90
• 1 引言81-82
• 2 材料82-83
• 2.1 试验材料82
• 2.2 主要试剂82
• 2.3 主要仪器82-83
• 3 方法83-85
• 3.1 还原酶的测定83
• 3.2 二硫键异构活性的测定83-84
• 3.3 分子伴侣活性的测定84-85
• 4 结果85-86
• 4.1 二硫键异构酶(MTH1745)的还原酶活性85
• 4.2 二硫键异构酶(MTH1745)的二硫键异构活性85-86
• 4.3 二硫键异构酶(MTH1745)的分子伴侣活性86
• 5 讨论86-87
• 6 参考文献87-90
• 第六章 二硫键异构酶(MTH1745)对大肠杆菌DSBA的互补分析90-106
• 1 引言90-91
• 2 材料91
• 2.1 试验材料91
• 2.2 主要试剂91
• 2.3 主要仪器91
• 3 方法91-101
• 3.1 构建质粒pFK19891-95
• 3.2 pFK200的构建95-100
• 3.3 JCB573,JCB579,JCB280,JCB583的构建100
• 3.4 碱性磷酸酶(AP)活性的检测100-101
• 4 结果101-104
• 4.1 嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(MTH1745)基因编码区的克隆101
• 4.2 pFK198质粒的构建和鉴定101-102
• 4.3 Apss,MTH1745和Apss-MTH1745的克隆102-103
• 4.4 pFK200质粒的构建和鉴定103
• 4.5 AP酶活性检测103-104
• 5 讨论104-105
• 6 参考文献105-106
• 第七章 结论、创新点与展望106-108
• 1 结论106-107
• 2 创新点107
• 3 有待进一步开展的工作107-108
• 附录108-116
• 附录一 常用试剂的配置108-112
• 附录二 本论文所用菌株和质粒一览表112-113
• 附录三 本论文所用引物一览表113-114
• 附录四 缩略词表114-115
• 附录五 攻读研究生期间发表、投稿的论文115-116
• 致谢116

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