淡水环境中新型酯酶和甲烷氧化菌的筛选与鉴定
淡水环境中新型酯酶和甲烷氧化菌的筛选与鉴定【摘要】:本论文的研究工作涉及环境微生物学的两个不同领域,第一部分是长江淡水微生物宏基因组文库的构建以及新型脂肪酶的筛选;第二部分是稻田淡
【学位授予单位】:中国科学技术大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q93
【目录】:
- 摘要5-7
- ABSTRACT7-15
- 第1章 绪论(环境宏基因组与甲烷氧化菌研究进展)15-56
- 1.1 引言15-16
- 第一部分 环境宏基因组与脂肪酶的筛选16-31
- 1.2 环境宏基因组研究技术进展16-30
- 1.2.1 环境宏基因组研究概况16-17
- 1.2.2 环境宏基因组的构建17-18
- 1.2.2.1 环境样品总DNA的提取17-18
- 1.2.2.2 载体的选择18
- 1.2.2.3 宿主的选择18
- 1.2.3 环境宏基因组文库的筛选18-23
- 1.2.3.1 文库筛选的可行性分析18-19
- 1.2.3.2 筛选文库的的方法19-21
- 1.2.2.3 各种环境宏基因组文库的筛选21-23
- 1.2.4 从环境宏基因组文库中筛选脂肪酶23-30
- 1.2.4.1 细菌脂肪酶简介23
- 1.2.4.2 细菌脂肪酶的研究概况23-24
- 1.2.4.3 细菌脂肪酶家族24-28
- 1.2.4.4 脂肪酶的用途28-29
- 1.2.4.5 环境中筛选脂肪酶29-30
- 1.3 本研究的目的和意义30-31
- 1.3.1 本研究的目的30
- 1.3.2 本研究的意义30-31
- 第二部分 新型甲烷氧化菌的筛选31-45
- 1.4 甲烷氧化菌研究进展31-43
- 1.4.1 甲烷氧化菌研究背景31-34
- 1.4.1.1 地球上甲烷的来源和消耗方式31-32
- 1.4.1.2 微生物介导的甲烷循环32-33
- 1.4.1.3 甲烷氧化菌概况33-34
- 1.4.1.4 甲烷氧化菌的研究进展34
- 1.4.2 甲烷氧化菌的分类34-35
- 1.4.3 甲烷氧化菌的生态分布35-36
- 1.4.4 甲烷氧化菌的特征酶36-39
- 1.4.5 甲烷氧化菌的研究方法39-43
- 1.4.5.1 以16S rRNA为基础的甲烷氧化菌的生态学研究39-40
- 1.4.5.2 功能性基因探针检测甲烷氧化菌40-41
- 1.4.5.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和反转录PER方法分析41-42
- 1.4.5.4 磷脂酸和同位素标记技术42-43
- 1.5 本研究的目的和意义43-45
- 1.5.1 本研究的目的43-44
- 1.5.2 本研究的意义44-45
- 参考文献45-56
- 第2章 长江淡水宏基因组文库中新型酯酶的筛选与鉴定56-83
- 2.1 引言56-57
- 第一部分 材料和方法57-70
- 2.2 试验基本材料57-58
- 2.2.1 淡水样品来源57
- 2.2.2 试验所用基本材料和仪器设备57-58
- 2.3 长江水微生物宏基因组库的建立58-60
- 2.3.1 长江淡水表层微生物的提取58
- 2.3.2 长江淡水宏基因组文库的建立58-60
- 2.3.2.1 长江水微生物基因组的提取58-59
- 2.3.2.2 酶切并回收大片段DN A59-60
- 2.3.2.3 构建BAC基因组文库60
- 2.4 新型酯酶的筛选与鉴定60-70
- 2.4.1 筛选带有脂肪酶基因的阳性克隆60
- 2.4.2 对阳性克隆进行亚克隆并测序分析60-70
- 2.4.2.1 菌种保存和扩大培养60-61
- 2.4.2.2 抽出阳性克隆中带有脂肪酶基因的质粒61
- 2.4.2.3 亚克隆以及测序分析61-62
- 2.4.2.4 分析测序结果62-63
- 2.4.2.5 构建EstY蛋白表达质粒63-65
- 2.4.2.6 EstY蛋白的表达与纯化65-67
- 2.4.2.7 EstY的酶活测试67-70
- 第二部分 结果与讨论70-82
- 2.5 宏基因组文库的构建70-73
- 2.5.1 长江水微生物大片段基因组的提取70
- 2.5.2 宏基因组文库的构建70-72
- 2.5.2.1 酶切并回收大片段DNA70
- 2.5.2.2 构建BAC基因组文库70-72
- 2.5.3 结果讨论72-73
- 2.6 新型酯酶的筛选与鉴定73-82
- 2.6.1 筛选带有脂肪酶基因的阳性克隆73
- 2.6.2 对阳性克隆进行亚克隆并测序分析73-76
- 2.6.2.1 亚克隆库的建立74
- 2.6.2.2 亚克隆库的筛选74
- 2.6.2.3 阳性亚克隆的序列分析74-76
- 2.6.3 酯酶基因EstY融合蛋白的表达和纯化76-77
- 2.6.4 EstY的酶活测试77-80
- 2.6.4.1 不同底物的酶活测定77-78
- 2.6.4.2 不同pH对酶活力的影响测定78
- 2.6.4.3 不同温度对酶活力的影响测定78
- 2.6.4.4 不同离子对酶活力的影响测定78
- 2.6.4.5 不同的有机溶剂及去污剂对酶活力的影响测定78
- 2.6.4.6 计算EstY的米氏常数78-80
- 2.6.5 结果讨论80-82
- 参考文献82-83
- 第3章 新型甲烷氧化菌的分离及特性研究83-111
- 3.1 引言83-84
- 第一部分 材料和方法84-100
- 3.2 实验配料84-88
- 3.2.1 试验仪器设备84
- 3.2.2 甲基氧化菌培养基及其它培养基组分84-87
- 3:2.3 其它试剂87-88
- 3.2.4 试验所用引物88
- 3.3 新型甲烷氧化菌的筛选与鉴定88-92
- 3.3.1 取样地点88
- 3.3.2 新型甲烷氧化菌的筛选88-89
- 3.3.3 新型甲烷氧化菌的鉴定89-92
- 3.3.3.1 新型甲烷氧化菌的基因组提取89-90
- 3.3.3.2 对新型甲烷氧化菌16S rRNA序列特异性扩增和测序90-92
- 3.3.3.3 16S rRNA的序列分析92
- 3.3.3.4 新型甲烷氧化菌的形态特征观察92
- 3.3.3.5 菌种保藏92
- 3.4 新型甲烷氧化菌的生理生化遗传学特性研究92-100
- 3.4.1 革兰氏染色法92-93
- 3.4.2 甲烷氧化细菌生长曲线及甲烷降解曲线的测定93
- 3.4.3 甲烷氧化菌温度梯度生长测定93
- 3.4.4 甲烷氧化菌pH梯度生长测定93
- 3.4.5 甲烷氧化细菌NaCl梯度实验方法93-94
- 3.4.6 唯一碳源试验94
- 3.4.7 唯一氮源试验94
- 3.4.8 过氧化氢试验94
- 3.4.9 脲酶测定试验94
- 3.4.10 甲烷氧化细菌特征酶基因pmoA,mxaF和mmoX的鉴定94-97
- 3.4.10.1 pmoA,mxaF和mmoX片段的扩增和测序94-97
- 3.4.10.2 pmoA基因片段的序列分析97
- 3.4.11 甲烷氧化菌的固氮酶基因nifH的鉴定97-100
- 3.4.11.1 固氮酶基因nifH片段的扩增与测序97-99
- 3.4.11.2 固氮酶基因nifH片段的鉴定99-100
- 第二部分 结果与讨论100-109
- 3.5 新型甲烷氧化菌的筛选与鉴定100-109
- 3.5.1 筛选结果100
- 3.5.2 甲烷氧化菌M261的形态特征100
- 3.5.3 甲烷氧化菌M261的鉴定结果与分析100-104
- 3.5.4 甲烷氧化菌M261的生理试验结果104-106
- 3.5.4.1 细菌革兰氏染色结果分析104
- 3.5.4.2 甲烷氧化细菌生长曲线及甲烷降解曲线104
- 3.5.4.3 甲烷氧化菌pH梯度生长结果104-105
- 3.5.4.4 甲烷氧化菌温度梯度生长测定105
- 3.5.4.5 甲烷氧化细菌NaCl梯度生长结果105
- 3.5.4.6 唯一碳源试验105
- 3.5.4.7 唯一氮源试验105
- 3.5.4.8 脲酶测定试验105
- 3.5.4.9 过氧化氢酶试验105-106
- 3.5.5 甲烷氧化菌M261的特征基因分析106-108
- 3.5.5.1 甲烷氧化细菌特征酶基因pmoA和mmoX的鉴定106
- 3.5.5.2 甲烷氧化菌的固氮酶基因nifH的鉴定106
- 3.5.5.3 甲烷氧化菌pmoA的系统发生树分析106-108
- 3.5.6 结果讨论108-109
- 参考文献109-111
- 致谢111-112
- 在读期间发表的学术论文112
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