3,3'-二吲哚甲烷在体及体外环境中抑制鼻咽癌细胞转移及侵袭能力机制的研究

【摘要】：目的：鼻咽癌起源于鼻咽的上皮层,在中国南方,东南亚,北非,阿拉斯加和格陵兰等地高发。鼻咽癌具有隐蔽性发生的特点,由于其无特异性早期症状、生长部位特殊且症状不易被患者和医生注意,极易造成漏诊误诊,且鼻咽癌易发生颈部淋巴结转移。鼻咽癌对放射治疗敏感,然而由于鼻咽癌的发病部位隐秘,早期症状不典型,大部分患者因颈部淋巴结转移就诊,此时已进入中晚期,单纯放疗治疗效果较差。且传统放化疗限制鼻咽癌发生颈部淋巴结转移的作用有限,并对正常的组织和器官有明显毒副作用,患者常难以耐受。淋巴结状态是影响无远处转移鼻咽癌患者总生存率的独立预后因素,所以抑制鼻咽癌的远处转移成为防治鼻咽癌的重要环节之一。 上皮间充质转化(EMT)是指上皮细胞在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞表型的转变,并获得迁移能力,它是一种基本的生理病理现象,在胚胎发育、组织发生中起重要作用。EMT还参与了多种纤维化疾病的形成、肿瘤的发生与发展以及侵袭转移等过程。在发生转移的部位,许多癌细胞表现出EMT,这是原始肿瘤发生播散的标志。目前认为EMT可能与上皮-间充质转化特征性标记物、转录调节因子、生长因子、微环境及MicroRNAs等有关。E-钙粘蛋白介导的细胞间黏附作用的丧失是肿瘤细胞侵袭和转移过程中的重要起始步骤,E-钙粘蛋白功能缺失或表达的下调将使E-钙粘蛋白介导的粘附功能受损,肿瘤细胞连接松散,容易脱离原发灶而发生转移。波形蛋白是多种肿瘤不良预后及转移的临床预后指标,在多种肿瘤细胞的异常高表达与侵袭和转移相关。转录因子Snail在调控胚胎EMT中具有重要作用。在大多数上皮性癌细胞snail与E-钙黏蛋白在mRNA与蛋白质水平存在逆反关系,缺乏E-钙黏蛋白的癌细胞往往存在snail的高表达。Slug也可以参与E-钙黏蛋白表达的抑制,增加波形蛋白的表达。MMP-9是降解细胞外基质和基底膜的主要执行者,被MMP-9降解细胞外基质蛋白片段可以调节上皮细胞的增生、侵袭、凋亡和迁移,有利于肿瘤浸润转移。 十字花科蔬菜如西兰花,菜花,胡萝卜被称为天然具有抗肿瘤活性的植物,3,3'-二吲哚甲烷(DIM)是从十字花科植物中提取的具有特殊分子结构的一种天然化合物,而且是十字花科植物发挥抗肿瘤作用的关键成分。且多项研究表明DIM对实验动物的正常组织和器官没有发现毒性的迹象。 本研究旨在探讨DIM对体内及体外鼻咽癌细胞侵袭和转移的能力是否有影响,其影响机制是否与上调E-钙黏蛋白的表达水平,下调波形蛋白,Snail, Slug, MMP-9等蛋白的表达水平相关。 方法：1.体外实验：选择高致瘤性,高转移性的鼻咽癌细胞5-8F细胞株,进行细胞传代与培养。运用流式细胞仪检测不同浓度DIM对人鼻咽癌5-8F细胞株凋亡率与细胞周期的影响。运用CCK-8检测不同浓度DIM对人鼻咽癌5-8F细胞株活性的影响。运用Hoechst染色法检测不同浓度DIM对人鼻咽癌5-8F细胞株细胞核形态的影响。运用transwell侵袭实验法,于200x显微镜下计数穿过聚碳酸酯滤膜滤膜的细胞数,比较不同浓度DIM对人鼻咽癌5-8F细胞株侵袭转移能力的影响。运用Western blot法检测不同浓度DIM对人鼻咽癌5-8F细胞株表达E-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail、Slug、MMP-9等EMT相关关键蛋白表达水平的影响。 2.体内实验：选择高致瘤性,高转移性的鼻咽癌细胞5-8F细胞株,进行细胞传代与培养。选择雌性,4-6周龄的BALB/c裸鼠,于SPF实验室,取对数生长期浓度为1×107/ml的鼻咽癌5-8F细胞株分别接种于4只裸鼠腋窝皮下,构建裸鼠移植瘤模型,将裸鼠完全随机分成三组,①空白对照组：标准饲料和水喂养②DIM处理组：肿瘤直径达5x5mm后给予含0.5%DIM的标准饲料和水喂养；③DIM预处理组：给予含0.5%DIM的标准饲料和水喂养2周后建立裸鼠移植瘤模型。8周后处死小鼠,按顺序分别对皮下移植瘤、肺脏、肝脏及可触及的淋巴结进行取材,观察淋巴结转移情况。 结果：1.体外实验：不添加DIM时,鼻咽癌5-8F细胞株穿透聚碳酸酯滤膜能力最强,随着DIM浓度增加,鼻咽癌5-8F细胞株穿透聚碳酸酯滤膜的能力逐渐减弱,DIM有效的抑制5-8F细胞在体外的侵袭与转移能力,呈浓度依赖性。DIM可显著提高E-钙黏蛋白表达水平,降低vimentin, slug, snail, MMP-9等蛋白表达水平,成浓度依赖性。2.体内实验：DIM可减少裸鼠肿瘤移植成功率,并减低荷瘤鼠发生淋巴结转移的机率,并延迟肿瘤发生、淋巴结转移发生的事件,呈浓度依赖性,同时,预先给予DIM作用效果最为明显。 结论：DIM能有效的调控E-钙黏蛋白,vimentin, slug, snail, MMP-9等EMT相关关键蛋白的表达水平,从而有效抑制鼻咽癌细胞在体内及体外的侵袭转移能力。 【关键词】：3 3’-二吲哚甲烷 鼻咽癌细胞 侵袭 转移 上皮间充质转变
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 论文创新点5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-13
• 第一部分 3,3'-Diindolylmethane(DIM)在体外实验中对NPC细胞转移及侵袭能力的抑制13-40
• 前言13-16
• 材料与方法16-25
• 结果25-29
• 讨论29-34
• 结论34-35
• 参考文献35-40
• 第二部分 3,3'-Diindolylmethane(DIM)在在体实验中对NPC细胞转移及侵袭能力的抑制40-55
• 前言40-43
• 材料与方法43-45
• 结果45-46
• 讨论46-49
• 结论49-50
• 参考文献50-55
• 综述55-79
• 参考文献69-79
• 博士期间发表论文79-80
• 致谢80

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